Διαφορά μεταξύ Probe και Primer

Κύρια διαφορά – Probe vs Primer

Η PCR είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη βιοτεχνολογία για την ενίσχυση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA για διάφορους σκοπούς. Ο ανιχνευτής και ο εκκινητής είναι δύο τύποι μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται σε διάφορους τύπους PCR. Οι ανιχνευτές χρησιμοποιούνται κυρίως στην qPCR ενώ συνθετικοί εκκινητές χρησιμοποιούνται σε κάθε τύπο PCR. Η κύρια διαφορά μεταξύ ανιχνευτή και εκκινητή είναι ότι ο ανιχνευτής χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA στο μείγμα μέσω του υβριδισμού με ένα δίκλωνο DNA, ενώ ο εκκινητής χρησιμοποιείται στην έναρξη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης με υβριδισμό με μονόκλωνο DNA . Γενικά, οι εκκινητές χρησιμοποιούνται για την έναρξη της αντιγραφής του DNA μέσα στο κύτταρο. Οι ανιχνευτές χρησιμοποιούνται επίσης σε αντιδράσεις υβριδισμού.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το Probe
     – Ορισμός, Σχέδιο, Σημασία
2. Τι είναι το Primer
     – Ορισμός, Σχέδιο, Σημασία
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ του Probe και του Primer
    – Περίληψη κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Probe και Primer
   – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι:Υβριδισμός, Ολιγονουκλεοτίδια, PCR, Primer, Probe, QPCR

Τι είναι το Probe

Ο ανιχνευτής είναι ένα θραύσμα DNA ή RNA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA σε ένα δείγμα. Επομένως, οι ανιχνευτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για δύο τύπους τεχνικών, στην qPCR και σε αντιδράσεις υβριδισμού. Τέσσερα γεγονότα θα πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά το σχεδιασμό ενός καθετήρα.

1. Τοποθεσία – Οι ανιχνευτές θα πρέπει να υβριδοποιούνται με τον κλώνο DNA σε κοντινή απόσταση από τον αντίστροφο ή τον εμπρόσθιο εκκινητή. Όμως, δεν πρέπει να επικαλύπτεται με τις θέσεις δέσμευσης του ασταριού. Γενικά, οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται με οποιαδήποτε αλυσίδα του διπλού DNA.
2. Θερμοκρασία τήξης (Tm) – Η θερμοκρασία τήξης του καθετήρα πρέπει να είναι 6-8 °C υψηλότερη από αυτή των ασταριών.
3. Θερμοκρασία ανόπτησης (Ta) – Η θερμοκρασία ανόπτησης του πειράματος πρέπει να είναι 5 °C χαμηλότερη από τη θερμοκρασία τήξης των ασταριών.
4. Περιεχόμενο GC – Η περιεκτικότητα σε GC του καθετήρα πρέπει να είναι 35-65%. Το 5′ άκρο του καθετήρα δεν πρέπει να περιέχει G.

Στο qPCR, οι ανιχνευτές επισημαίνονται με φθορίζουσες βαφές ή ραδιενεργά στοιχεία. Αυτοί οι ανιχνευτές υβριδίζονται με την αλληλουχία στόχο στο διπλό DNA. Διαφορετικοί τύποι επισημασμένων ανιχνευτών, είτε με ραδιενεργά στοιχεία είτε με φθορισμό, χρησιμοποιούνται επίσης σε διάφορους τύπους αντιδράσεων υβριδισμού. Ο υβριδισμός των ανιχνευτών PNA στις αλληλουχίες-στόχους τους φαίνεται στο σχήμα 1 . Οι ανιχνευτές PNA χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του μήκους των τελομερών.

Εικόνα 1:Υβριδισμός ανιχνευτών PNA

Κατά τον υβριδισμό, οι ανιχνευτές συνδέονται με το μονόκλωνο DNA με συμπληρωματικό τρόπο.

Τι είναι το Primer

Το primer αναφέρεται σε μια μικρή αλυσίδα DNA ή RNA που χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης της σύνθεσης DNA. Οι εκκινητές RNA χρησιμοποιούνται μέσα στο κύτταρο για την έναρξη της αντιγραφής του DNA με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης. Οι συνθετικοί εκκινητές DNA χρησιμοποιούνται κυρίως στην PCR για την ενίσχυση του επιθυμητού θραύσματος DNA. Η αλληλουχία στόχος πλαισιώνεται από δύο εκκινητές γνωστούς ως εμπρόσθιο εκκινητή και αντίστροφο εκκινητή. Ειδικότητα και συμπληρωματικότητα είναι οι πρωταρχικοί παράγοντες στο σχεδιασμό των ασταριών. Θα πρέπει επίσης να αποφεύγονται οι δευτερεύουσες δομές. Άλλοι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά το σχεδιασμό των εκκινητών περιγράφονται παρακάτω.

1. Θερμοκρασία τήξης (Tm) – Η βέλτιστη θερμοκρασία τήξης τόσο του μπροστινού όσο και του ανάποδου ασταριού πρέπει να είναι 60-64 °C.
2. Θερμοκρασία ανόπτησης – Η θερμοκρασία ανόπτησης του πειράματος πρέπει να είναι 5 °C χαμηλότερη από τη θερμοκρασία τήξης κάθε ασταριού.
3. Περιεχόμενο GC – Η περιεκτικότητα σε GC των ασταριών πρέπει να είναι 35-65%.

Η ανόπτηση του εμπρόσθιου και του ανάστροφου εκκινητή στους δύο κλώνους του DNA στόχου φαίνεται στο σχήμα 2.

Εικόνα 2:Ανόπτηση ασταριού

Στον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA, χρησιμοποιούνται εκκινητές για την ενίσχυση του θραύσματος στόχου. Οι εκκινητές μπορούν να επισημανθούν είτε με ραδιενεργά στοιχεία είτε με φθορισμό για διάφορους σκοπούς ανίχνευσης.

Similarities Between Probe and Primer

• Ο ανιχνευτής και ο εκκινητής είναι δύο τύποι μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται σε διάφορες τεχνικές PCR για υβριδισμό με συμπληρωματικό DNA.
• Τόσο ο ανιχνευτής όσο και ο εκκινητής είναι ειδικά για ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA.
• Τόσο ο ανιχνευτής όσο και ο εκκινητής μπορεί να είναι DNA/RNA.
• Τόσο οι ανιχνευτές όσο και ο εκκινητής έχουν συγκεκριμένες θερμοκρασίες για ανόπτηση με την αλληλουχία στόχο.
• Τόσο ο ανιχνευτής όσο και ο εκκινητής μπορούν να εμπλακούν με ένα φθοροφόρο για την ανίχνευση.

Διαφορά μεταξύ Probe και Primer

Ορισμός

Probe: Ο ανιχνευτής είναι ένα θραύσμα DNA ή RNA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA μέσα σε ένα δείγμα.

Primer: Το Primer είναι ένας σύντομος κλώνος DNA ή RNA που χρησιμεύει ως το σημείο εκκίνησης για τη σύνθεση DNA.

Ρόλος

Probe: Οι ανιχνευτές χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA σε qPCR.

Primer: Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται για την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Χρησιμοποιείται επίσης στην έναρξη της PCR.

Μήκος

Probe: Το μήκος ενός καθετήρα μπορεί να κυμαίνεται από 25-1000 ζεύγη βάσεων.

Primer: Το μήκος ενός ασταριού μπορεί να κυμαίνεται από 18-22 ζεύγη βάσεων.

Υβριδισμός

Probe: Οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται με δίκλωνο DNA.

Primer: Οι εκκινητές υβριδίζονται με μονόκλωνο DNA.

Ετικέτα

Probe: Οι ανιχνευτές είναι γενικά επισημασμένοι με ένα φθοροφόρο για την ανίχνευση.

Primer: Οι εκκινητές μπορούν να επισημανθούν με βάση το σκοπό.

Συμπέρασμα

Ο ανιχνευτής και ο εκκινητής είναι δύο τύποι μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται σε διάφορους τύπους PCR. Οι ανιχνευτές χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA σε qPCR. Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται για την έναρξη της αντιγραφής του DNA μέσα στο κύτταρο και χρησιμοποιούνται επίσης για την έναρξη της PCR. Επομένως, η κύρια διαφορά μεταξύ ανιχνευτή και εκκινητή είναι ο σκοπός τους.

Αναφορά:

1. Σχεδιασμός εκκινητών και ανιχνευτών PCR , Integrated DNA Technologies, Διατίθεται εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Ροή εργασιών Q-FISH" Από τον Jclam στην Αγγλική Wikipedia (CC BY 3.0) μέσω του Commons Wikimedia
2. "Primers RevComp Elongation" του Richard Wheeler (Zephyris) – Δική του δουλειά (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia