Πώς να απομονώσετε το mRNA από το ολικό RNA

Οι συνδυασμοί oligo-dT/φορέα χρησιμοποιούνται κυρίως για τον καθαρισμό του mRNA από το ολικό RNA με μια τεχνική γνωστή ως χρωματογραφία συγγένειας. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι για την απομόνωση του mRNA από το συνολικό RNA με βάση τον τύπο των κυττάρων. Δηλαδή, άμεση μέθοδος απομόνωσης mRNA και μείον μέθοδος απομόνωσης mRNA. Και οι δύο μέθοδοι επεξηγούνται σε αυτό το άρθρο.

Το αγγελιοφόρο RNA (mRNA) είναι ένα προϊόν μεταγραφής, το οποίο αποτελείται από μια σειρά νουκλεοτιδίων RNA. Μεταφέρει πληροφορίες σε γονίδια από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Η απομόνωση RNA από μια συγκεκριμένη κυτταρική σειρά οδηγεί σε ολικό RNA, το οποίο αποτελείται από rRNA και tRNA μαζί με mRNA. Ως εκ τούτου, το mRNA θα πρέπει να διαχωριστεί από το μείγμα ολικού RNA κατά τη μελέτη του μεταγραφώματος της κυτταρικής σειράς. Για τον διαχωρισμό χρησιμοποιούνται μοναδικές ιδιότητες του mRNA, όπως η παρουσία μιας ουράς πολυ(Α) στο 3' άκρο του μορίου mRNA. Δεδομένου ότι τα μόρια ολιγο-dT είναι συμπληρωματικά της ουράς πολυ(Α), το mRNA μπορεί να απομονωθεί από ένα μείγμα ολικού RNA.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το mRNA
     – Ορισμός, Δομή, Συνάρτηση
2. Ποια είναι η Σύνθεση του Ολικού RNA
    – mRNA, rRNA, tRNA
3. Πώς να απομονώσετε το mRNA από το ολικό RNA
    – Χρήση μορίων Oligo-dT/Carrier

Βασικοί όροι:Χρωματογραφία συγγένειας, RNA Messenger (mRNA), Μέθοδος μείον, Oligo dT, Poly(A) ουρά, Ολικό RNA

Τι είναι το mRNA

Το mRNA είναι μεταγραφή ενός γονιδίου που κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Παράγεται μέσα στον πυρήνα σε ευκαρυώτες και μεταφέρει πληροφορίες για την παραγωγή μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα. Μεταφράζεται σε μια αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης κατά τη μετάφραση, υποβοηθούμενη από ριβοσώματα. Το πρωτεύον μεταγράφημα που παράγεται από τη μεταγραφή των ευκαρυωτών ονομάζεται προ-mRNA.

Εικόνα 1:Δομή mRNA

Κατά τη διάρκεια μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων, παράγεται ένα ώριμο μόριο mRNA με πολλά χαρακτηριστικά, όπως 5' cap και poly(A) ουρά. Το συνολικό mRNA ενός συγκεκριμένου οργανισμού είναι γνωστό ως μεταγραφικό του.

Τι είναι η σύνθεση του ολικού RNA

Το αποτέλεσμα της απομόνωσης RNA ονομάζεται συνολικό RNA. Αποτελείται και από τους τρεις κύριους τύπους RNA που παράγεται από ένα κύτταρο. Είναι mRNA, tRNA και rRNA. Τόσο το tRNA όσο και το rRNA βοηθούν στη μετάφραση. Το μέγεθος του ευκαρυωτικού mRNA είναι 0,5-20 kb. Το RNA μεταφοράς (tRNA) φέρνει τα αντίστοιχα αμινοξέα κατά τη μετάφραση. Έχει μήκος 76-90 ζεύγη βάσεων και αποτελείται από περιοχή αντικωδικονίου, η οποία είναι συμπληρωματική σε ένα συγκεκριμένο κωδικόνιο στο mRNA. Το ριβοσωμικό RNA (rRNA) είναι συστατικό των ριβοσωμάτων. Ορισμένα από τα ανθρώπινα rRNA έχουν μήκος 5 kb.

Πάνω από το 90% του συνολικού RNA αποτελείται από tRNA και rRNA. Μόνο το 1-5% του συνολικού RNA είναι mRNA. Ένα τυπικό κύτταρο θηλαστικού μπορεί να αποτελείται από περίπου 500.000 μόρια mRNA ανά κύτταρο. Η ποσότητα ενός συγκεκριμένου τύπου mRNA μπορεί να είναι 15-20.000 αντίγραφα ανά κύτταρο.

Πώς να απομονώσετε mRNA από ολικό RNA

Μια σειρά από τεχνικές μοριακής βιολογίας, όπως η κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA, η προετοιμασία δείγματος για προετοιμασία μικροσυστοιχίας, η ανάλυση στυπώματος Northern για γονίδια ασθενώς εκφρασμένα, κ.λπ. απαιτούν mRNA υψηλής ποιότητας. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι για την απομόνωση του mRNA από το συνολικό RNA με βάση τον τύπο των κυττάρων:άμεση μέθοδος απομόνωσης mRNA και μείον μέθοδος απομόνωσης mRNA.

Άμεση μέθοδος απομόνωσης mRNA

Η αρχή του διαχωρισμού του ώριμου mRNA από το ευκαρυωτικό ολικό RNA περιλαμβάνει την επιλογή συγγένειας/χρωματογραφία συγγένειας πολυαδενυλιωμένου mRNA με τη χρήση ολίγο dT (ολιγοδεοξυμιδυλικό), το οποίο είναι συμπληρωματικό του πολυ(Α) ουρά. Γίνεται δυνατό από την απουσία ουράς πολυ(Α) στους δύο άλλους τύπους RNA:tRNA και rRNA.

Το mRNA αποτελείται από 30-200 νουκλεοτίδια αδενίνης στην πολυ(Α) ουρά του. Στήλες συγγένειας γεμάτες με συνδυασμό ολίγο dT/φορέα χρησιμοποιούνται για την απομόνωση mRNA από ολικό RNA. Ο συνδυασμός ολίγο dT/φορέα μπορεί να είναι είτε δεσμευμένο σε κυτταρίνη ολίγο dT, βιοτινυλιωμένο ολίγο dT με μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα με στρεπταβιδίνη ή σφαιρίδια πολυστυρενίου-λάτεξ συζευγμένα με ολίγο dT. Όλες οι πειραματικές συνθήκες θα πρέπει να βρίσκονται σε συνθήκες χωρίς RNase για να αποτραπεί η ενζυματική διάσπαση του RNA.

Εικόνα 2:Χρωματογραφία συγγένειας

Το συνολικό RNA θα πρέπει να διαλυθεί σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι και να θερμανθεί για λίγο στους 65-70 °C για να διαταραχθούν οι δευτερογενείς δομές του RNA. Οι συνθήκες για την απομόνωση του RNA ποικίλλουν μεταξύ των εμπορικά διαθέσιμων κιτ για απομόνωση mRNA. Ωστόσο, η παρασκευή του πολυ(Α)-RNA ή του mRNA αποτελείται από τρία στάδια.

1. Υβριδισμός πολυ(Α)-RNA σε μόρια ολίγο dT που συνδέονται με φορέα
2. Ξέπλυμα μη δεσμευμένου RNA
3. Έκλουση πολυ(Α)-RNA από συνδυασμό ολιγο-dT/φορέα υπό συνθήκες χαμηλής αυστηρότητας

Μείον Μέθοδος απομόνωσης mRNA

Ο καθαρισμός του mRNA με βάση το Oligo dT αποδίδει μόνο mRNA με ουρά πολυ(Α) ή ώριμο ευκαρυωτικό mRNA. Ως εκ τούτου, μια άλλη μέθοδος γνωστή ως μέθοδος μείον μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον καθαρισμό mRNA που δεν έχουν ουρά πολυ(Α). Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση mRNA από ζυμομύκητες και βακτηριακό ολικό RNA. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί στην απομόνωση ανώριμου τύπου mRNA μαζί με το ώριμο mRNA από ευκαρυωτικά κύτταρα. Περιλαμβάνει τον εμπλουτισμό του μεταγραφώματος με την εξάντληση του μεγάλου ριβοσωμικού RNA από το συνολικό RNA. Το κιτ απομόνωσης RiboMinus Transcriptome της ThermoFisher Scientific χρησιμοποιεί τρία βήματα για τον αποτελεσματικό καθαρισμό του mRNA από ζυμομύκητες και ολικό RNA βακτηρίων.

1. Υβριδισμός ολικού RNA με ειδικούς για την αλληλουχία rRNA, 5' επισημασμένους με βιοτίνη ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές
2. Αφαίρεση συμπλέγματος ανιχνευτή σημασμένου με rRNA/5'-βιοτίνη μαζί με τα επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη μαγνητικά σφαιρίδια
3. Καθαρισμός ακαθαρσιών και έκλουση mRNA.

Συμπέρασμα

Το συνολικό RNA αποτελείται από τους τρεις κύριους τύπους RNA:mRNA, rRNA και tRNA. Ο καθαρισμός του mRNA από το συνολικό RNA είναι απαραίτητος για την ανάλυση του μεταγραφώματος ενός συγκεκριμένου οργανισμού. Οι μέθοδοι καθαρισμού βασίζονται στον τύπο του mRNA. Το ευκαρυωτικό mRNA, το οποίο περιέχει μια ουρά πολυ(Α), μπορεί να απομονωθεί με χρωματογραφία συγγένειας με ολίγο dT. Ανώριμα ευκαρυωτικά mRNA και mRNA από ζυμομύκητες και βακτηριακά κύτταρα μπορούν να απομονωθούν με την εξάντληση του μεγάλου rRNA από το συνολικό RNA.

Αναφορά:

1. «Εξαγωγή mRNA». Thermo Fisher Scientific, Διαθέσιμο εδώ.
2 "Εξαγωγή RNA κατά τύπο RNA." Thermo Fisher Scientific, Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. "Mature mRNA" (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia
2. "Affinity" Από Jamit στα Αγγλικά Wikibooks – Μεταφέρθηκε από τα en.wikibooks στα Commons από τον Adrignola χρησιμοποιώντας CommonsHelper (Δημόσιος Τομέας) μέσω Commons Wikimedia