Πώς λειτουργεί το Western Blotting

Το Western blotting είναι μια τεχνική στη μοριακή βιολογία που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης μέσα σε ένα δείγμα. Χρησιμοποιεί SDS-PAGE για να διαχωρίσει τις πρωτεΐνες με βάση το μέγεθός τους και στη συνέχεια αυτές οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μια μεμβράνη. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί συγκεκριμένα πρωτογενή αντισώματα στην επισήμανση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης στο στύπωμα. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που είναι επισημασμένα με πρωτεΐνες αναφοράς ανιχνεύουν τις επισημασμένες πρωτεΐνες με το πρωτεύον αντίσωμα.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το Western Blotting
     – Ορισμός, Γεγονότα, Εφαρμογές
2. Πώς λειτουργεί το Western Blotting
     – Διαδικασία Western Blotting

Βασικοί όροι:Ανάπτυξη χρώματος, Μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, Πρωτεύον αντίσωμα, Δευτερεύον αντίσωμα, Western Blotting

Τι είναι το Western Blotting

Το Western blotting είναι μια τεχνική υβριδισμού που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης μέσα σε ένα δείγμα. Ονομάζεται επίσης ανοσοστύπωμα, καθώς η τεχνική χρησιμοποιεί αντισώματα τόσο για την επισήμανση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει όσο και για την ανίχνευση των σημασμένων με αντίσωμα πρωτεϊνών.

Εικόνα 1:Western Blot

Το Western blotting αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Towbin το 1979 και σήμερα χρησιμοποιείται ως τεχνική ρουτίνας ανάλυσης πρωτεϊνών.

Πώς Λειτουργεί το Western Blotting

Το Western blotting χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σε ένα δείγμα. Τα βήματα της τεχνικής Western blotting περιγράφονται παρακάτω.

1. SDS-PAGE – Το δείγμα πρωτεΐνης διαχωρίζεται με βάση το μέγεθός τους με SDS-PAGE.
2. Μεταφορά πρωτεϊνών σε μια μεμβράνη – Οι κλασματοποιημένες κατά μέγεθος πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνη είτε νιτροκυτταρίνης είτε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι τεχνικές που εμπλέκονται σε αυτή τη μεταφορά είναι η μεταφορά διάχυσης.
3. Αποκλεισμός μη συγκεκριμένων τοποθεσιών – Οι μη κατειλημμένες θέσεις στη μεμβράνη αποκλείονται για να αποτραπεί η μη ειδική δέσμευση πρωτεϊνών. Για το σκοπό αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί μη λιπαρό ξηρό γάλα ή αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA).
4. Πρωτογενής επώαση αντισωμάτων – Η φραγμένη μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα πρωτογενούς αντισώματος. Αυτά τα πρωτογενή αντισώματα συνδέονται με μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη στη μεμβράνη.
5. Δευτερογενής επώαση αντισωμάτων – Η μεμβράνη επωάζεται με δευτερογενή αντισώματα, τα οποία συνδέονται με τα πρωτογενή αντισώματα. Τα δευτερογενή αντισώματα είναι συζευγμένα με πρωτεΐνες αναφοράς. Αυτές οι πρωτεΐνες αναφοράς μπορεί να είναι βιοτίνη, αλκαλική φωσφατάση ή υπεροξειδάση χρένου.
6. Ανίχνευση πρωτεΐνης με ανάπτυξη χρώματος – Οι ανταποκριτές συζευγμένου ενζύμου αντιδρούν με το υπόστρωμά τους για να δημιουργήσουν μια έγχρωμη αλκαλική φωσφατάση μετατρέπει το BCIP σε προϊόν μπλε χρώματος ενώ η υπεροξειδάση αγριοραπανιού μετατρέπει τη λουμινόλη, εκπέμποντας φωταύγεια.

Εικόνα 2:Western Blotting – Διαδικασία

Συμπέρασμα

Το Western blotting είναι μια τεχνική υβριδισμού που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σε ένα δείγμα. Χρησιμοποιεί το SDS-PAGE για να διαχωρίσει τις πρωτεΐνες με βάση το μέγεθός τους και τη δέσμευσή τους με πρωτογενή αντισώματα, τα οποία μπορούν να αναγνωριστούν από δευτερεύοντα αντισώματα κατά την ανάπτυξη χρώματος.

Αναφορά:

1. «Βασική αρχή του Western Blotting, Πώς λειτουργούν τα Western Blot». Boster , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Anti-lipoic acid immunoblot» By TimVickers – Own work (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. «Western Blotting» By Cawang – Own work, CC0) μέσω Commons Wikimedia