Πώς λειτουργεί το Southern Blotting

Η κηλίδα Southern είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση συγκεκριμένου θραύσματος DNA σε ένα δείγμα. Η τεχνική αποτύπωσης περιλαμβάνει τον διαχωρισμό θραυσμάτων DNA με βάση το μέγεθος μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης, μεταφορά του δείγματος DNA κλασματοποιημένου μεγέθους σε μια μεμβράνη φίλτρου, υβριδισμό των συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA με έναν επισημασμένο, ειδικό για την αλληλουχία ανιχνευτή και ανίχνευση των επισημασμένων ζωνών.

Εκτός από την αναγνώριση συγκεκριμένου DNA σε ένα δείγμα, το μέγεθος και η αφθονία ενός συγκεκριμένου τύπου DNA μπορούν επίσης να προσδιοριστούν με στύπωμα Southern. Η διαδικασία που εμπλέκεται στο Southern blotting περιγράφεται σε αυτό το άρθρο.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Τι είναι το Southern Blotting
     – Ορισμός, Αρχή, Εφαρμογές
2. Πώς λειτουργεί το Southern Blotting
     – Διαδικασία Southern Blotting

Βασικοί όροι:DNA, ηλεκτροφόρηση γέλης, ανιχνευτής υβριδισμού, νάιλον μεμβράνη, περιοριστική πέψη, Southern blotting

Τι είναι το Southern Blotting

Η κηλίδα Southern είναι μια τεχνική υβριδισμού που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση συγκεκριμένου DNA σε ένα δείγμα. Η τεχνική αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τον Edward M. Southern το 1975. Αυτή η διαδικασία προσδιορίζει τις αλληλουχίες DNA, το μέγεθος και την αφθονία μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA μέσα σε ένα δείγμα.

Μια μεμβράνη κηλίδωσης Southern φαίνεται στο σχήμα 1.

Εικόνα 1:Southern Blotting Membrane

Εφαρμογές του Southern Blotting

Οι εφαρμογές του Southern blotting περιγράφονται παρακάτω.

1. Για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA
2. Για να απομονωθεί ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA
3. Για τον εντοπισμό μεταλλάξεων και γονιδιακών ανακατατάξεων
4. Σε προσδιορισμούς RFLP (πολυμορφισμός μήκους θραύσματος περιορισμού)
5. Για τον εντοπισμό γενετικών ασθενειών
6. Για τον εντοπισμό μολυσματικών παραγόντων
7. Δοκιμή πατρότητας
8. Στη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA για τον εντοπισμό εγκληματιών

Πώς λειτουργεί το Southern Blotting

Η κηλίδωση Southern περιλαμβάνει τον διαχωρισμό θραυσμάτων DNA με βάση το μέγεθος μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης, τη μεταφορά τους σε μια μεμβράνη, τον υβριδισμό τους με έναν επισημασμένο, ειδικό για την αλληλουχία ανιχνευτή και την ανίχνευση των επισημασμένων ζωνών . Τα βήματα του Southern blotting περιγράφονται παρακάτω.

1. πέψη DNA – Το δείγμα DNA υποβάλλεται σε πέψη με ένζυμα περιορισμού για τη λήψη θραυσμάτων DNA και αυτά τα θραύσματα ενισχύονται με PCR.
2. Ηλεκτροφόρηση γέλης – Τα θραύσματα DNA κλασματοποιούνται ανάλογα με το μέγεθος με ηλεκτροφόρηση γέλης.
3. Μετουσίωση – Το πήκτωμα με κλασματοποιημένο DNA εμποτίζεται σε NaOH ή HCl για να μετουσιωθεί το δίκλωνο DNA.
4. Αποτύπωση – Τα θραύσματα DNA στο πήκτωμα μεταφέρονται σε μια θετικά φορτισμένη νάιλον μεμβράνη με μια διαδικασία που ονομάζεται στύπωμα.
5. Ψήσιμο και αποκλεισμός – Το στυπόχαρτο με θραύσματα DNA ψήνεται για να στερεωθεί το DNA στη μεμβράνη. Στη συνέχεια, οι μη κατειλημμένες θέσεις δέσμευσης κορεσθούν με επεξεργασία με λευκωματίνη ορού βοοειδών (BSA) ή καζεΐνη.
6. Υβριδισμός με επισημασμένους ανιχνευτές – Η συνδεδεμένη με το DNA μεμβράνη υποβάλλεται σε επεξεργασία με έναν επισημασμένο ανιχνευτή που περιέχει συμπληρωματική νουκλεοτιδική αλληλουχία προς το ενδιαφερόμενο θραύσμα DNA. Οι ανιχνευτές υβριδισμού έχουν γενικά μήκος 100-500 bp και είναι επισημασμένοι με ραδιενεργά νουκλεοτίδια.
7. Οπτικοποίηση με αυτοραδιόγραμμα – Η μεμβράνη που συνδέεται με τον ανιχνευτή οπτικοποιείται με αυτοραδιογράφημα για να ληφθούν τα μοτίβα του ενδιαφερόμενου θραύσματος DNA.

Εικόνα 2:Southern Blotting

Η όλη διαδικασία του Southern blotting φαίνεται στην εικόνα 2 .

Συμπέρασμα

Η κηλίδα Southern είναι μια τεχνική υβριδισμού που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA από ένα δείγμα. Σε αυτή τη διαδικασία, το δείγμα DNA κλασματοποιείται με ένζυμα περιορισμού, και το μείγμα τρέχει σε ένα πήκτωμα. Στη συνέχεια, το σχέδιο ζωνών στο πήκτωμα μεταφέρεται σε μια νάιλον μεμβράνη και υβριδοποιείται με έναν επισημασμένο ανιχνευτή, ο οποίος επιτρέπει την ανίχνευση του ενδιαφερόμενου θραύσματος.

Αναφορά:

1. "Southern Blotting". Thermo Fisher Scientific , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Southern blot membrane» Του Bojan Žunar – Δικό έργο (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia
2. "Εικόνα 17 01 05" Από CNX OpenStax –  (CC BY 4.0) μέσω Commons Wikimedia