Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing

Η κύρια διαφορά  μεταξύ της αλληλουχίας Maxam Gilbert και Sanger είναι ότι η Η αλληλουχία Maxam-Gilbert είναι η χημική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA με βάση το νουκλεοβάση -συγκεκριμένη μερική χημική τροποποίηση του DNA και επακόλουθη  διάσπαση του κορμού του DNA σε τοποθεσίες που γειτνιάζουν με το τροποποιημένο  νουκλεοτίδια. Αλλά, από την άλλη πλευρά, η αλληλουχία Sanger είναι η μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας, η οποία διακόπτει την επιμήκυνση των αλληλουχιών DNA με την ενσωμάτωση του  διδεοξυνουκλεοτίδια  στις ακολουθίες. Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας Maxam Gilbert χρησιμοποιεί μεγάλη ποσότητα επικίνδυνων χημικών, συμπεριλαμβανομένου ραδιενεργού υλικού και υδραζίνης. Ωστόσο, η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιεί λιγότερο επικίνδυνες χημικές ουσίες.

Η αλληλούχιση των Maxam Gilbert και Sanger είναι οι δύο συμβατικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που αναπτύχθηκαν στα μέσα της δεκαετίας του 1970. Γενικά, είναι υπεύθυνα για τον προσδιορισμό των βάσεων νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο DNA.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται 

1. Τι είναι η αλληλουχία Maxam Gilbert
     – Ορισμός, Διαδικασία, Σημασία
2. Τι είναι η αλληλουχία Sanger
     – Ορισμός, Διαδικασία, Σημασία
3. Ποιες είναι οι ομοιότητες μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing
     – Περίληψη κοινών χαρακτηριστικών
4. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing
     – Σύγκριση βασικών διαφορών

Βασικοί όροι 

Συμβατικές μέθοδοι, Αλληλουχία DNA, Αλληλουχία Maxam Gilbert, Αλληλουχία Sanger

Τι είναι η αλληλουχία Maxam Gilbert 

Η ανάλυση αλληλουχίας Maxam Gilbert είναι μία από τις δύο συμβατικές μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που αναπτύχθηκαν από τον  Allan Maxam και Walter Gilbert το 1977–1980. Επίσης, είναι γνωστή ως η χημική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.

Επισκόπηση 

Βασικά, αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει την τερματική επισήμανση των μορίων DNA με χημικούς παράγοντες που ακολουθείται από την τροποποίηση των βάσεων του DNA σε τέσσερις διαφορετικές χημικές αντιδράσεις. Στη συνέχεια, το DNA διασπάται στο σημείο σύνδεσης των τροποποιημένων βάσεων A+ G, G, C + T και C. Στη συνέχεια, συντίθενται ραδιενεργά θραύσματα που εκτείνονται από το σημασμένο άκρο μέχρι τη θέση της νουκλεοτιδικής βάσης. Στο τέλος, το PAGE διαχωρίζει το σημείο θραύσης, παράγοντας τέσσερα διαφορετικά μοτίβα διάσπασης για καθεμία από τις τέσσερις βάσεις του DNA.

Χημεία 

Τα βήματα του Maxam Gilbert Sequencing είναι: 

1. Ραδιενεργή επισήμανση του άκρου 5' με αντίδραση κινάσης χρησιμοποιώντας γάμα-32P ATP και καθαρισμό   
2. Τέσσερις χημικές επεξεργασίες για βάσεις A+ G,  G, C + T, C  (Αποπουρίνωση πουρινών (A+G) από  μυρμηκικό οξύ, Μεθυλίωση γουανίνης (G) από  θειικό διμεθυλεστέρα, Υδρόλυση πυριμιδινών  (C+T) από υδραζίνη και Αναστολή της αντίδρασης υδραζίνης για τη θυμίνη με την προσθήκη χλωριούχου νατρίου, υδρολύοντας  μόνο την κυτοσίνη (C)
3. Διάσπαση του τροποποιημένου DNA από θερμή πιπεριδίνη. (CH2)5NH  στη θέση της τροποποιημένης βάσης που παράγει μια σειρά επισημασμένων θραυσμάτων από το ραδιοσημασμένο άκρο μέχρι την πρώτη θέση «κοπής».
4. Κλασματοποίηση μεγέθους των θραυσμάτων σε PAGE (ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου).
5. Οπτικοποίηση με αυτοραδιογραφία,  συμπεραίνοντας την ακολουθία.

   Εικόνα 1:Αλληλουχία Maxam Gilbert

Σημασία

Βασικά, τα δύο κύρια σημαντικά χαρακτηριστικά της αλληλουχίας Maxam Gilbert είναι ότι είναι ταυτόχρονα ευαίσθητη και συγκεκριμένη. Ως εκ τούτου, μπορεί να παρέχει μια καλή διάκριση μεταξύ των βάσεων. Ωστόσο, χρειάζονται μερικές ημέρες για να αναλυθεί μια ακολουθία με 200-300 βάσεις. Από την άλλη, χρησιμοποιεί τόσο ραδιενεργά στοιχεία όσο και υδραζίνη, που είναι νευροτοξίνη.

Τι είναι το Sanger Sequencing 

Η αλληλούχιση Sanger είναι η δεύτερη συμβατική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τους συνεργάτες του το 1977. Σημαντικά, διατέθηκε στο εμπόριο από την Applied Biosystems.

Επισκόπηση 

Γενικά, η αλληλουχία Sanger είναι επίσης γνωστή ως η μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας που βασίζεται στην ενσωμάτωση διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddNTPs) που τερματίζουν την αλυσίδα μέσω in vitro αντιγραφής του DNA από την πολυμεράση DNA. Είναι σημαντικό ότι τα ddNTP στερούνται μιας ομάδας 3'-ΟΗ που είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού με το εισερχόμενο νουκλεοτίδιο, με αποτέλεσμα η DNA πολυμεράση να σταματήσει την επέκταση του DNA με την ενσωμάτωση του τροποποιημένου ddNTP. Επίσης, αυτά τα ddNTP  επισημαίνονται είτε ραδιενεργά είτε με φθορισμό, επιτρέποντας την ανίχνευση της βάσης.

Χημεία 

Τα βήματα της αλληλουχίας Sanger είναι:  

1. Διαίρεση του δείγματος DNA σε τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις αλληλούχισης με ddATP, ddCTP, ddGTP και ddTTP.
2. Σήμανση φθορισμού (ddATP με πράσινη βαφή, ddCTP με μπλε χρώμα, ddGTP με κίτρινη βαφή και ddTTP με κόκκινη βαφή)
3. Διεξαγωγή ξεχωριστών αντιδράσεων PCR με το αντίστοιχο ddNTP. Εδώ, η συγκέντρωση διδεοξυνουκλεοτιδίου θα πρέπει να είναι περίπου 100 φορές χαμηλότερη από αυτή του αντίστοιχου δεοξυνουκλεοτιδίου.
4. Μετουσίωση θερμότητας και διαχωρισμός αμπλικονίων σε μετουσιωτική γέλη πολυακρυλαμιδίου-ουρίας. Τέσσερις αντιδράσεις εκτελούνται σε μία από τις τέσσερις μεμονωμένες λωρίδες (λωρίδες A, T, G, C).
5. Οπτικοποίηση και προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA.

   Εικόνα 2:Αλληλουχία Sanger

Σημασία 

Σημαντικά, η αλληλουχία Sanger είναι μια πολύ απλοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Ως εκ τούτου, η εμφάνιση της μεθόδου έδωσε ώθηση στον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, επιτρέποντας μια πιο γρήγορη συσσώρευση δεδομένων αλληλουχίας για διάφορα γονίδια και οργανισμούς. Ωστόσο, δεν χρησιμοποιεί πολλές επικίνδυνες χημικές ουσίες στη διαδικασία. Ωστόσο, η ευαισθησία της μεθόδου αλληλουχίας Sanger είναι συγκριτικά χαμηλή.

Ομοιότητες μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing  

• Η αλληλουχία των Maxam Gilbert και Sanger είναι τα δύο συμβατικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.
• Επίσης, είναι οι πρώτες μέθοδοι -αλληλουχία γενιάς.
• Σημαντικά, και τα δύο είναι χρονοβόρα και δυσκίνητη σε σύγκριση με την αυτοματοποιημένη αλληλουχία.
• Επίσης, επιτρέπουν την ανάλυση σύντομων Θραύσματα DNA έως και 500 βάσεις.
• Ωστόσο, και οι δύο κλώνοι του θραύσματος DNA μπορεί να ακολουθήσει.
• Γενικά, οι αρχές τους οδήγησαν στην ανάπτυξη μεθόδων αλληλούχισης επόμενης γενιάς.

Διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger Sequencing 

Ορισμός 

Η ανάλυση αλληλουχίας Maxam Gilbert αναφέρεται στη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται σε μερική χημική τροποποίηση ειδική για νουκλεοτίδια και επακόλουθη διάσπαση του DNA. Αντίθετα, η αλληλουχία Sanger αναφέρεται στη διαδικασία επιλεκτικής ενσωμάτωσης διδεοξυνουκλεοτιδίων που τερματίζουν την αλυσίδα από την DNA πολυμεράση κατά τη διάρκεια in vitro Αντιγραφή DNA.

Αναπτύχθηκε από 

Η αλληλουχία Maxam Gilbert αναπτύχθηκε από τους  Allan Maxam και Walter Gilbert το 1977–1980 ενώ η αλληλουχία Sanger αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τους συνεργάτες του το 1977.  

Γνωστό ως 

Η αλληλουχία Maxam Gilbert είναι η χημική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας, ενώ η αλληλουχία Sanger είναι η μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας.

Χημικά

Η αλληλούχιση του Maxam Gilbert χρησιμοποιεί μεγάλη ποσότητα επικίνδυνων χημικών, συμπεριλαμβανομένων ραδιενεργών υλικών και υδραζίνης, ενώ η αλληλουχία Sanger χρησιμοποιεί λιγότερο επικίνδυνες χημικές ουσίες.

Ευαισθησία και ειδικότητα 

Η αλληλουχία του Maxam Gilbert είναι εξαιρετικά ευαίσθητη και πολύ συγκεκριμένη, ενώ η αλληλουχία Sanger είναι λιγότερο ευαίσθητη και λιγότερο συγκεκριμένη.

Συμπέρασμα 

Η ανάλυση αλληλουχίας Maxam Gilbert είναι μία από τις δύο συμβατικές μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας DNA. Γενικά, χρησιμοποιεί διάφορες χημικές ουσίες για την ειδική τροποποίηση νουκλεοτιδικών βάσεων στον κλώνο του DNA. Τελικά, η διάσπαση του DNA στις τροποποιημένες θέσεις επιτρέπει τον προσδιορισμό των βάσεων. Είναι σημαντικό ότι αυτή η μέθοδος είναι πιο ευαίσθητη και συγκεκριμένη. Ωστόσο, χρησιμοποιεί επικίνδυνες χημικές ουσίες. Αντίθετα, η αλληλούχιση Sanger είναι η δεύτερη συμβατική μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως. Συνήθως, χρησιμοποιεί επισημασμένα ddNTPs για να τερματίσει την ανάπτυξη της αλυσίδας κατά την αντιγραφή του DNA σε καθένα από τα τέσσερα νουκλεοτίδια. Τέλος, ο διαχωρισμός των τερματικών αμπλικονίων σε ένα πήκτωμα επιτρέπει τον προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος είναι λιγότερο συγκεκριμένη και λιγότερο ευαίσθητη σε σχέση με την πρώτη μέθοδο. Ωστόσο, χρησιμοποιεί λιγότερο επικίνδυνες χημικές ουσίες. Επομένως, η κύρια διαφορά μεταξύ Maxam Gilbert και Sanger sequencing είναι η μέθοδος και η σημασία.

Αναφορές:

1. «Αλληλουχία DNA». Ολοκληρωμένες Τεχνολογίες DNA . Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Maxam-Gilbert sequencing en» By Incnis Mrsi. Μπορείτε να δείτε το πρωτότυπο εδώ:Maxam-Gilbert sequencing.svg. (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia   
2. "Sanger-sequencing" Από τον Estevezj – Δικό έργο (CC BY-SA 3.0) μέσω Commons Wikimedia