Ένας επιστήμονας θέλει να είναι σε θέση να παράγει τεχνητά μια πρωτεΐνη που παράγεται στα συκώτια των βατράχων. Έχει εντοπίσει όλο το mRNA από το ήπαρ και το cDNA. Τι shou;
1. Απομονώστε το mRNA για την πρωτεΐνη -στόχο:
* Εκχύλιση RNA: Ο επιστήμονας θα χρειαστεί να αποκτήσει ο ήπατος από βατράχους και να εξαγάγει το συνολικό RNA. Αυτό συνεπάγεται τη διαταραχή των κυττάρων και τη χρήση εξειδικευμένων αντιδραστηρίων για να διαχωρίσει το RNA από άλλα κυτταρικά συστατικά.
2. Δημιουργήστε μια βιβλιοθήκη cDNA:
* Αντίστροφη μεταγραφή: Χρησιμοποιώντας το απομονωμένο mRNA, ο επιστήμονας θα εκτελέσει αντίστροφη μεταγραφή. Αυτή είναι μια διαδικασία όπου ένα ένζυμο που ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση μετατρέπει το mRNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Αυτό το cDNA θα χρησιμεύσει ως πρότυπο για την κλωνοποίηση.
* Κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA: Το cDNA στη συνέχεια εισάγεται σε φορείς (συνήθως πλασμίδια) που μπορούν να αναπαραχθούν μέσα στα βακτήρια. Αυτή η συλλογή διανυσμάτων που περιέχουν διαφορετικά θραύσματα cDNA ονομάζεται βιβλιοθήκη cDNA.
3. Προβάλλετε τη βιβλιοθήκη για το cDNA Target:
* Σχεδιασμός ανιχνευτή: Ο επιστήμονας χρειάζεται έναν ανιχνευτή για να εντοπίσει το cDNA που κωδικοποιεί την επιθυμητή πρωτεΐνη βάτραχος. Αυτός ο ανιχνευτής μπορεί να είναι:
* Ολυμποτερυγικός ανιχνευτής: Μια σύντομη, συνθετική αλληλουχία DNA που σχεδιάστηκε με βάση τη γνωστή ακολουθία της πρωτεΐνης -στόχου (αν υπάρχει).
* ανιχνευτής αντισώματος: Ένα αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη στόχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του αντίστοιχου cDNA στη βιβλιοθήκη.
* Προβολή: Η βιβλιοθήκη cDNA εξετάζεται με τον ανιχνευτή. Αυτό μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως:
* υβριδοποίηση αποικιών: Τα βακτήρια που περιέχουν τη βιβλιοθήκη cDNA είναι τοποθετημένα σε άγαρ. Ο ανιχνευτής επισημαίνεται και επιτρέπεται να δεσμεύεται με τις αποικίες. Οι αποικίες που περιέχουν το cDNA στόχου θα υβριδοποιούνται με τον ανιχνευτή και μπορούν να εντοπιστούν.
* Προβολή προβολής PCR: Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση του cDNA στόχου χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένα από τη γνωστή αλληλουχία.
4. Ακολουθία και επαληθεύστε το cDNA στόχου:
* Sanger Sequencing: Μόλις απομονωθεί το cDNA στόχου, πρέπει να προσβληθεί αλληλουχία για να επιβεβαιώσει την ταυτότητά του και να διασφαλίσει ότι κωδικοποιεί τη σωστή πρωτεΐνη.
* Ανάλυση βιοπληροφορικής: Η αλληλουχία cDNA μπορεί να συγκριθεί με τις βάσεις δεδομένων για να βρει ομόλογες αλληλουχίες και να επιβεβαιώσει την ταυτότητά της.
5. Σχεδιάστε και κατασκευάστε ένα διάνυσμα έκφρασης:
* διάνυσμα έκφρασης: Ο επιστήμονας θα χρειαστεί ένα διάνυσμα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εκφράσει την πρωτεΐνη -στόχο σε έναν κατάλληλο οργανισμό ξενιστή (π.χ. βακτήρια, ζύμη ή κύτταρα θηλαστικών). Αυτό το διάνυσμα έκφρασης θα περιλαμβάνει:
* Προαγωγός: Μια αλληλουχία DNA που οδηγεί την έκφραση του γονιδίου στόχου.
* γονίδιο στόχου (cDNA): Το απομονωμένο cDNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη βάτραχου.
* Θέση δέσμευσης ριβοσώματος (RBS): Μια ακολουθία που βοηθά τα ριβοσώματα να ξεκινήσουν τη σύνθεση πρωτεϊνών.
* Δείκτης επιλογής: Ένα γονίδιο που επιτρέπει την επιλογή κυττάρων που έχουν λάβει τον φορέα έκφρασης.
6. Μετατρέψτε το φορέα έκφρασης σε οργανισμό υποδοχής:
* Μετασχηματισμός: Ο φορέας έκφρασης που περιέχει το cDNA στόχου εισάγεται σε έναν οργανισμό ξενιστή (π.χ. βακτηριακά κύτταρα).
* Επιλογή: Τα μετασχηματισμένα κύτταρα επιλέγονται χρησιμοποιώντας τον δείκτη επιλογής στον φορέα έκφρασης.
7. Εκφράστε και καθαρίστε την πρωτεΐνη στόχου:
* Έκφραση πρωτεΐνης: Τα κύτταρα ξενιστή αναπτύσσονται υπό συνθήκες που προάγουν την έκφραση της πρωτεΐνης -στόχου.
* Καθαρισμός πρωτεΐνης: Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται από τα κύτταρα και καθαρίζεται χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως η χρωματογραφία για να το χωρίσει από άλλα κυτταρικά συστατικά.
8. Χαρακτηρισμός και ανάλυση:
* επαλήθευση: Η καθαρισμένη πρωτεΐνη αναλύεται για να επιβεβαιώσει την ταυτότητα, την αναδίπλωση και τη δραστηριότητά της.
* Λειτουργικές μελέτες: Η πρωτεΐνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω έρευνα, όπως η διερεύνηση της λειτουργίας της, οι αλληλεπιδράσεις με άλλα μόρια ή οι πιθανές θεραπευτικές χρήσεις της.
Σημαντικές εκτιμήσεις:
* Αναδίπλωση πρωτεΐνης: Η εξασφάλιση της σωστής διπλώματος της πρωτεΐνης στον οργανισμό υποδοχής είναι ζωτικής σημασίας.
* μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις: Ορισμένες πρωτεΐνες απαιτούν τροποποιήσεις (π.χ. γλυκοζυλίωση) μετά τη μετάφραση. Ο οργανισμός υποδοχής μπορεί να μην είναι σε θέση να εκτελέσει αυτές τις τροποποιήσεις, οι οποίες θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης.
* Ηθική και ασφάλεια: Πρέπει να ακολουθηθούν κατάλληλες ηθικές εκτιμήσεις και πρωτόκολλα ασφαλείας όταν εργάζεστε με ιστούς βάτραχου και γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς.
Επιτρέψτε μου να ξέρω αν θέλετε περισσότερες λεπτομέρειες σε οποιοδήποτε συγκεκριμένο βήμα!
