Απομόνωση ενζύμων από υπο -κυτταρικούς οργανισμούς;
Απομόνωση ενζύμων από υποκυτταρικούς οργανισμούς
Εισαγωγή
Τα ένζυμα είναι βιολογικοί καταλύτες που επιταχύνουν τις βιοχημικές αντιδράσεις στους ζωντανούς οργανισμούς. Για να μελετήσουν και να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά τα ένζυμα, είναι ζωτικής σημασίας να τα απομονώσουν από το κυτταρικό τους πλαίσιο. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τον διαχωρισμό του επιθυμητού ενζύμου από άλλα κυτταρικά συστατικά, όπως πρωτεΐνες, λιπίδια και νουκλεϊνικά οξέα. Η επιλεγμένη μέθοδος εξαρτάται από το συγκεκριμένο ένζυμο, τη θέση του εντός του κυττάρου και το επιθυμητό επίπεδο καθαρότητας.
Μέθοδοι για απομόνωση ενζύμων
1. Διαταραχή των κυττάρων:
* Μηχανικές μέθοδοι:
* ομογενοποίηση: Χρησιμοποιώντας ένα μπλέντερ ή ομογενοποιητή για να σπάσει τα ανοιχτά κύτταρα με φυσική δύναμη.
* Sonication: Χρησιμοποιώντας κύματα υπερήχων για να διαταράξουν τις κυτταρικές μεμβράνες.
* Γαλλικός Τύπος: Εφαρμόζοντας υψηλή πίεση για να εξαναγκάσουν τα κύτταρα μέσω ενός μικρού στόματος, διαταράσσοντας τη δομή τους.
* Χημικές μέθοδοι:
* απορρυπαντικά: Διαταράσσοντας τις κυτταρικές μεμβράνες διακόπτοντας τις διπλοστοιβάδες των λιπιδίων.
* Οσμωτικό σοκ: Χρησιμοποιώντας μια υποτονική λύση για να προκαλέσει διόγκωση και ρήξη κυττάρων.
* Ενζυματική πέψη: Χρησιμοποιώντας ένζυμα όπως η λυσοζύμη για να διασπαστούν τα τοιχώματα των κυττάρων.
2. Κλασματοποίηση κυττάρων:
* Διαφορική φυγοκέντρηση: Διαχωρίζοντας τα συστατικά των κυττάρων με βάση την πυκνότητα και το μέγεθος τους. Αυτό περιλαμβάνει μια σειρά φυγοκεντρημάτων σε αυξανόμενες ταχύτητες, με αποτέλεσμα τα σφαιρίδια που περιέχουν διαφορετικά οργανίδια.
* φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας: Χρησιμοποιώντας μια κλίση πυκνότητας για να διαχωρίζουν τα κυτταρικά συστατικά με βάση την πυκνότητα τους.
3. Χρωματογραφία:
* Χρωματογραφία στήλης: Διαχωρίζοντας τα μόρια με βάση τη συγγένειά τους σε μια στατική φάση συσκευασμένη σε μια στήλη.
* Χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων: Διαχωρισμός με βάση τη χρέωση.
* Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους: Διαχωρισμός με βάση το μοριακό μέγεθος.
* χρωματογραφία συγγένειας: Διαχωρισμός με βάση συγκεκριμένες ιδιότητες δέσμευσης.
* HPLC (υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης): Μια τεχνική υψηλής ανάλυσης για τον διαχωρισμό και τον εντοπισμό ενώσεων.
4. Ηλεκτροφόρηση:
* SDS-PAGE (Ηλεκτροφόρηση πηκτώματος με δωδεκυλοθειικό νάτριο): Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση το μοριακό βάρος.
5. Βροχόπτωση:
* βροχόπτωση θειικού αμμωνίου: Χρησιμοποιώντας υψηλές συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου για επιλεκτικά κατακρημνισμένες πρωτεΐνες.
Παράδειγμα:Απομόνωση λακτάσης από Ε. Coli
1. Διαταραχή των κυττάρων: Αναπτύξτε το Ε. Coli σε ένα κατάλληλο μέσο και στη συνέχεια διαταράξτε τα κύτταρα χρησιμοποιώντας υπερήχους.
2. φυγοκέντρηση: Αφαιρέστε τα συντρίμμια των κυττάρων με φυγοκέντρηση.
3. χρωματογραφία: Χρησιμοποιήστε χρωματογραφία συγγένειας με ρητίνη συνδεδεμένη με λακτόζη για να δεσμεύσετε και να καθαρίσετε τη λακτάση.
4. Dialysis: Αφαιρέστε τα άλατα και άλλες μολυσματικές ουσίες από το καθαρισμένο διάλυμα λακτάσης.
Βασικές εκτιμήσεις για την απομόνωση ενζύμων:
* σταθερότητα: Τα ένζυμα είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία, το ρΗ και άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες.
* Δραστηριότητα: Βεβαιωθείτε ότι η μέθοδος που έχει επιλεγεί δεν μειονεί ή απενεργοποιεί το ένζυμο.
* Καθαρότητα: Το απαιτούμενο επίπεδο καθαρότητας εξαρτάται από την εφαρμογή.
* απόδοση: Βελτιστοποιήστε τη διαδικασία για μέγιστη ανάκτηση ενζύμου.
Εφαρμογές απομονωμένων ενζύμων
Τα απομονωμένα ένζυμα έχουν πολλές εφαρμογές σε:
* Βιοτεχνολογία: Παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων, βιοκαυσίμων και άλλων βιολογικών προϊόντων.
* Ιατρική διάγνωση: Ανίχνευση και παρακολούθηση ασθενειών.
* Βιομηχανία τροφίμων: Παραγωγή τυριού, γιαούρτι και άλλα ζυμωμένα τρόφιμα.
* Περιβαλλοντικές εφαρμογές: Βιοαποικοδόμηση των ρύπων.
Συμπέρασμα
Η απομόνωση των ενζύμων είναι μια πολύπλοκη και ουσιαστική διαδικασία σε διάφορους επιστημονικούς τομείς. Οι συγκεκριμένες μέθοδοι και τεχνικές που χρησιμοποιούνται θα ποικίλουν ανάλογα με το ένζυμο -στόχο και την εφαρμογή του. Η επιτυχημένη απομόνωση ενζύμου απαιτεί προσεκτική εξέταση παραγόντων όπως η σταθερότητα, η δραστηριότητα, η καθαρότητα και η απόδοση του ενζύμου.
