Πώς θα ξέρετε αν τα βακτηριακά κύτταρα μετασχηματίστηκαν κατά τη διάρκεια του εργαστηρίου;
1. Επιλογή για μετασχηματισμένα κύτταρα
* Αντοχή στα αντιβιοτικά: Η πιο συνηθισμένη μέθοδος βασίζεται στη συμπερίληψη ενός γονιδίου αντοχής στα αντιβιοτικά μέσα στο πλασμίδιο. Αυτό το γονίδιο επιτρέπει στα μετασχηματισμένα βακτήρια να επιβιώσουν σε ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει αυτό το συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Τα μη μετασχηματισμένα βακτήρια δεν θα αναπτυχθούν.
* Άλλοι επιλεγμένοι δείκτες: Ορισμένα πλασμίδια μεταφέρουν γονίδια που παρέχουν εναλλακτικά πλεονεκτήματα επιλογής όπως:
* Αλλαγή χρώματος: Παράγοντας ένα χρωματιστό προϊόν (όπως μπλε/λευκή προβολή) ή αλλαγή χρώματος αποικιών.
* Ανάπτυξη σε συγκεκριμένα μέσα: Επιτρέποντας την ανάπτυξη στα μέσα ενημέρωσης που στερούνται συγκεκριμένης θρεπτικής ουσίας που απαιτούν κανονικά τα βακτήρια.
2. Επαλήθευση της ενσωμάτωσης πλασμιδίου
* PCR: Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας γονιδίων από το πλασμίδιο. Αυτό επιβεβαιώνει την παρουσία του πλασμιδικού ϋΝΑ εντός των μετασχηματισμένων βακτηρίων.
* Περιορισμός ενζύμου πέψη: Ειδικά ένζυμα κόβουν το DNA σε μοναδικές αλληλουχίες. Η ανάλυση του μεγέθους των θραυσμάτων DNA μετά την πέψη μπορεί να επιβεβαιώσει την παρουσία του πλασμιδίου και την ακεραιότητά του.
* ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ DNA: Αυτή η τεχνική καθορίζει άμεσα την ακριβή ακολουθία του DNA εντός των μετασχηματισμένων βακτηρίων. Επιβεβαιώνει την παρουσία του εισαγόμενου γονιδίου και αποκλείει τυχόν ανεπιθύμητες μεταλλάξεις.
3. Λειτουργική ανάλυση (ανάλογα με το γονίδιο)
* Έκφραση μιας πρωτεΐνης: Εάν το πλασμίδιο φέρει ένα γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, μπορείτε να δοκιμάσετε την παρουσία αυτής της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως οι δοκιμασίες Western blotting ή ενζύμων.
* Αλλαγή φαινοτύπου: Εάν το γονίδιο που εισάγεται στο πλασμίδιο επηρεάζει τον βακτηριακό φαινότυπο (π.χ. την ικανότητα παραγωγής ενός συγκεκριμένου ενζύμου ή να αλλάξει τον μεταβολισμό του), μπορείτε να παρατηρήσετε αυτές τις αλλαγές στα μετασχηματισμένα βακτήρια.
Παράδειγμα:ένα κοινό πείραμα μετασχηματισμού
1. πλασμίδια: Χρησιμοποιείτε ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα γονίδιο για αντίσταση αμπικιλλίνης (AMPR) και ένα γονίδιο για μια φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP).
2. Μετασχηματισμός: Εισάγετε το πλασμίδιο σε βακτήρια.
3. Επιλογή: Αναπτύσσετε τα βακτήρια σε μια πλάκα άγαρ που περιέχει αμπικιλλίνη. Μόνο τα βακτήρια με το γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης θα αναπτυχθούν.
4. επαλήθευση: Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε PCR για να ελέγξετε για την παρουσία του γονιδίου GFP και στη συνέχεια να παρατηρήσετε τις αποικίες κάτω από ένα μικροσκόπιο για φθορισμό.
Σημαντικές εκτιμήσεις:
* Ομάδες ελέγχου: Πάντα περιλαμβάνουν αρνητικούς μάρτυρες (μη μετασχηματισμένα βακτήρια) και θετικούς μάρτυρες (βακτήρια που είναι γνωστό ότι μετασχηματίζονται με το συγκεκριμένο πλασμίδιο) για να επικυρώσουν τα αποτελέσματά σας.
* Αποδοτικότητα: Η απόδοση μετασχηματισμού είναι το ποσοστό των βακτηρίων που αναλαμβάνουν με επιτυχία το πλασμίδιο. Αυτό μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το βακτηριακό στέλεχος, το πλασμίδιο και τη μέθοδο μετασχηματισμού.
* Πολλαπλές τεχνικές: Συχνά, ένας συνδυασμός τεχνικών επιλογής, επαλήθευσης και λειτουργικής ανάλυσης παρέχει την πιο ισχυρή επιβεβαίωση του επιτυχημένου μετασχηματισμού.
Επιτρέψτε μου να ξέρω αν έχετε περισσότερες ερωτήσεις σχετικά με ένα συγκεκριμένο πρωτόκολλο μετασχηματισμού ή πείραμα!
