Πολλαπλασιασμός κάκτων in vitro για την αξιολόγηση της γενετικής σταθερότητας των αναγεννημένων φυτών

Οι κάκτοι είναι όμορφα φυτά. Ανήκουν στην οικογένεια Cactaceae και έχουν μοναδική μορφολογία. Οι κλαδίδες τους (το «στέλεχος» των φυτών) και οι ράχες τους, καθώς και τα άνθη τους, χρησιμοποιούνται για διάφορους σκοπούς, από ιατρικές πρακτικές από ιθαγενείς όπου αυτά τα φυτά απαντώνται φυσικά ή μέχρι να κάνουν το σαλόνι λίγο πιο γοητευτικό.

Δεδομένου ότι οι κάκτοι είναι μια παγκόσμια τάση στην αγορά των καλλωπιστικών φυτών, οι άνθρωποι είτε τους καλλιεργούν είτε τους παίρνουν από τους φυσικούς τους βιότοπους προκειμένου να καλύψουν αυτή τη ζήτηση. Έτσι, οι πληθυσμοί κάκτων απειλούνται από αυτήν την παράνομη συλλογή, πέρα ​​από την καταστροφή των οικοτόπων τους από ανθρώπινες ενέργειες.

Πώς λοιπόν μπορούν οι κάκτοι να προστατεύονται και να καλλιεργούνται ταυτόχρονα; Με την εκτέλεση μελετών πολλαπλασιασμού και διατήρησης σε μέλη της οικογένειας Cactaceae.

Γιατί να φυτέψουμε ιστούς;

Η ιστοκαλλιέργεια είναι ένα σύνολο τεχνικών που επιτρέπουν στους ερευνητές να καλλιεργούν διαφορετικούς τύπους ζωντανών ιστών (όπως σε όργανα, κύτταρα και άλλα) σε ένα εργαστήριο για διάφορες μελέτες. Άρα η καλλιέργεια φυτικών ιστών είναι η καλλιέργεια φυτικών οργάνων (π.χ. φύλλα, μίσχοι, ρίζες), ιστών (π.χ. μεριστώματα, κάλοι κ.λπ.) και κύτταρα σε ένα εργαστήριο. Για ποιο λόγο, θα ρωτήσετε;

Στην περίπτωση της συγκεκριμένης μελέτης, το in vitro Ο πολλαπλασιασμός με τη χρήση φυτών που έχουν φυτρώσει στο εργαστήριο μπορεί να καλύψει τη ζήτηση της αγοράς καλλωπιστικών, προστατεύοντας ταυτόχρονα την ακεραιότητα των φυσικών πληθυσμών έμμεσα, και εξακολουθεί να παρέχει φυτά για πρωτοβουλίες επανεισαγωγής. Με άλλα λόγια, από λίγους καρπούς κάκτων που λαμβάνονται σε φυσικούς πληθυσμούς, ένα εργαστήριο καλλιέργειας φυτικών ιστών μπορεί να παράγει φυτά που θα ανταποκρίνονται στη ζήτηση της διακοσμητικής αγοράς και οι άνθρωποι δεν θα χρειαστεί να πάρουν φυτά απευθείας από τη φύση.

Γιατί να ασχοληθώ με τη γενετική;

Οι μελέτες γενετικής πιστότητας έχουν δείξει ότι ο μικροπολλαπλασιασμός (η παραγωγή φυτών σε εργαστήριο καλλιέργειας φυτικών ιστών) μπορεί να δημιουργήσει γενετικά διακριτά φυτά, ένα φαινόμενο γνωστό ως σωματοκλωνική παραλλαγή. Αυτή η παραλλαγή μπορεί να παρουσιαστεί με διάφορες μορφές, αλλά εδώ την ορίζουμε ως οποιαδήποτε αλλαγή στο φαινότυπο, τον γονότυπο ή τα επιγενετικά χαρακτηριστικά ενός φυτού. Αυτό σημαίνει ότι οποιαδήποτε αλλαγή είναι απροσδόκητη, καθώς τα φυτά που δημιουργούνται σε μελέτες μικροπολλαπλασιασμού συνήθως υποτίθεται ότι είναι κλώνοι και οι κλώνοι υποτίθεται ότι είναι πανομοιότυποι μεταξύ τους και του φυτού-δότη.

Αυτές οι σωματοκλωνικές παραλλαγές μπορεί να μην προκαλέσουν διαφορά στην εμφάνιση ενός φυτού ή να το κάνουν να πεθαίνει πιο εύκολα ή να έχει διαφορετικό χρώμα ή να το κάνει στείρο και ούτω καθεξής. Είναι κυρίως απρόβλεπτο. Καθώς μπορεί να διαταράξει την ομοιομορφία και τους ρυθμούς παραγωγής, καθώς και να παρουσιάσει πραγματικό πρόβλημα για πρωτοβουλίες επανεισαγωγής στα φυσικά ενδιαιτήματα των φυτών, η σωματοκλωνική παραλλαγή είναι συνήθως κάτι που οι ερευνητές προσπαθούν συνεχώς να εντοπίσουν και να αποφύγουν.

Πώς μπορούμε να δούμε τις μεταλλάξεις στους κάκτους που πολλαπλασιάσαμε;

Δεδομένου ότι το DNA είναι μικροσκοπικό και διατηρείται μέσα στον πυρήνα των φυτικών κυττάρων, πρέπει να έχουμε πρόσβαση στα μόρια του DNA εξάγοντας το DNA από ένα κομμάτι των κάκτων. Στη συνέχεια, πρέπει να καθαρίσουμε και να καθαρίσουμε αυτό το διάλυμα που περιέχει το DNA του κάκτου (οι κάκτοι έχουν πολλούς υδατάνθρακες που μπορούν να εμποδίσουν την εξαγωγή DNA καλής ποιότητας) και να ενισχύσουμε περιοχές αυτού του DNA που μπορεί να μας δείξουν διακύμανση μεταξύ ενός κάκτου και των κλώνων του. Αυτή η ενίσχυση γίνεται με PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), χρησιμοποιώντας DNA, Taq πολυμεράση και όλα τα απαραίτητα «συστατικά» για τη δημιουργία εκατομμυρίων θραυσμάτων DNA από τις συγκεκριμένες περιοχές που θέλουμε να εξετάσουμε. Ποιες συγκεκριμένες περιοχές, που ονομάζονται μοριακούς δείκτες DNA, πρόκειται να παρουσιάσουν διακύμανση είναι απρόβλεπτο, επομένως πρέπει να δοκιμαστούν αρκετές περιοχές, χρησιμοποιώντας αρκετούς διαφορετικούς κάκτους και τους αντίστοιχους κλώνους τους. Οι εργασίες με δείκτες Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) (συγκεκριμένες περιοχές DNA μεταξύ επαναλαμβανόμενων τόπων DNA) ήταν αποτελεσματικές στην ανίχνευση σωματοκλωνικών διαφοροποιήσεων σε πολλούς κάκτους στο παρελθόν, επομένως αυτές ήταν οι περιοχές που εξετάσαμε.

Αλλά το DNA είναι ένα μόριο, πώς το βλέπετε; Αφού έχετε ενισχύσει τις περιοχές που θέλετε να εξετάσετε χρησιμοποιώντας τη διαδικασία PCR, καταλήγετε με μια καλή ποσότητα DNA. Αυτό μπορεί να τοποθετηθεί σε ένα πήκτωμα και, χρησιμοποιώντας ηλεκτρικό ρεύμα, τα θραύσματα DNA θα διαχωριστούν μέσα στο πήκτωμα (επειδή το DNA είναι ηλεκτρικά φορτισμένο). Αυτό το ονομάζουμε ηλεκτροφόρηση. Αυτό που αναλύουμε είναι τα μοτίβα που σχηματίζονται στο τζελ μετά την ηλεκτροφόρηση, τα οποία μπορούμε να δούμε μόλις χρωματίσουμε το DNA και χρησιμοποιήσουμε το υπεριώδες φως για να μπορέσουμε πραγματικά να δούμε και να φωτογραφίσουμε αυτά τα μοτίβα. Εάν τα σχέδια ενός κάκτου και των κλώνων του είναι τα ίδια, τότε υποθέτουμε ότι δεν υπάρχει καμία παραλλαγή σε αυτήν την περιοχή. Ωστόσο, εάν υπάρχει διαφορετικό μοτίβο μπάντας μεταξύ τους, αυτό θα σήμαινε ότι έγινε μετάλλαξη.

Τι κάναμε και τι ανακαλύψαμε

Τα δύο είδη κάκτων που μελετήσαμε, Micranthocereus flaviflorus subsp. densiflorus και Μ. πολύανθος subsp. alvinii , εμφανίζονται μόνο φυσικά στην πολιτεία Μπαΐα. Ο κύριος στόχος μας ήταν να μικροπολλαπλασιάζουμε αυτά τα είδη και να αξιολογήσουμε τη γενετική σταθερότητα των αναγεννημένων φυτών, πράγμα που σημαίνει ότι θέλαμε να δούμε αν οι κλώνοι που παράγαμε ήταν όντως κλώνοι ή είχαν κάποια μετάλλαξη σε αυτούς. Για να γίνει αυτό, οι βλαστοί που λάβαμε από in vitro Τα βλαστημένα φυτά εμβολιάστηκαν σε MS/2 (ένας τύπος μέσου καλλιέργειας) για επαγωγή μορφογένεσης. Η μορφογένεση είναι η διαδικασία ενός φυτού που παράγει όργανα, ή σε αυτή την περίπτωση, βλαστούς. Αυτοί οι βλαστοί διαχωρίστηκαν από το φυτό δότη τους και πέρασαν ξανά την ίδια διαδικασία. Αυτό επαναλήφθηκε για τρεις διαδοχικές υποκουλτούρες.

Παρατηρήσαμε ότι όχι μόνο οι βλαστοί του κάκτου συνέχισαν να παράγουν περαιτέρω βλαστούς, διατηρώντας το μορφογονικό τους δυναμικό, αλλά το έκαναν πιο γρήγορα μετά τα τρία επόμενα γεγονότα πολλαπλασιασμού. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας τους βλαστούς ως πηγή εκφυτεύματος, το in vitro πολλαπλασιασμός του M. flaviflorus και Μ. πολύανθος θα μπορούσε να βελτιστοποιηθεί για 90 και 60 ημέρες διάρκειας, αντίστοιχα.

Ναι, οι κάκτοι, ακόμη και σε εργαστηριακές συνθήκες, αναπτύσσονται πολύ αργά.

Όταν εξετάσαμε τα σχέδια στα πηκτώματα ηλεκτροφόρησης, ανακαλύψαμε ότι όλα τα φυτά-δότες, και από τα δύο είδη, είχαν δημιουργήσει βλαστούς χωρίς ορατή σωματοκλωνική παραλλαγή στις περιοχές που μελετήσαμε, πράγμα που σήμαινε υψηλή γενετική σταθερότητα στο in vitro πολλαπλασιασμός κατά τη διάρκεια τριών διαδοχικών υποκαλλιεργειών βλαστών.

Το μέλλον

Η μελέτη ενός μεγαλύτερου αριθμού υποκαλλιεργειών προτείνεται για την αξιολόγηση του δυναμικού μορφογένεσης και της γενετικής πιστότητας μακροπρόθεσμα για τα δύο είδη που μελετήσαμε σε αυτήν την εργασία. Το συνιστούμε επειδή όσο περισσότερο χρόνο περνούν τα φυτά in vitro και όσο περισσότεροι κύκλοι πολλαπλασιασμού εκτελούνται σε αυτά, τόσο μεγαλύτερες είναι οι πιθανότητες εμφάνισης σωματοκλωνικών παραλλαγών.

Ενθαρρύνουμε τη μελέτη άλλων ειδών κάκτων προκειμένου να βοηθήσουμε τις προσπάθειες διατήρησης και πολλαπλασιασμού σε ολόκληρο τον κόσμο και να μπορέσουμε όλοι να απολαύσουμε αυτά τα όμορφα φυτά και να τα αφήσουμε να ευδοκιμήσουν στο φυσικό τους περιβάλλον.

Αυτά τα ευρήματα περιγράφονται στο άρθρο με τίτλο In vitro πολλαπλασιασμός και γενετική σταθερότητα δύο ειδών Micranthocereus Backeb. (Cactaceae) ενδημικό της Bahia, Βραζιλία, που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Επικεφαλής αυτής της εργασίας ήταν η Laila Civatti από το Universidade Federal da Bahia.