Πώς να υπολογίσετε την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης

Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης μπορεί να υπολογιστεί μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί επί του συνόλου των κυττάρων σε ένα συγκεκριμένο δείγμα. Ο αριθμός των κελιών μπορεί να μετρηθεί με δύο μεθόδους. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η χρήση δημοσιογράφων που μπορούν να αποδοθούν εύκολα. Αυτοί οι ανταποκριτές μπορεί να είναι η πράσινη πρωτεΐνη φθορισμού (GFP), η λουσιφεράση, η βήτα-γαλακτοσιδάση, η εκκρινόμενη αλκαλική φωσφατάση (SEAP). Η πιο πρόσφατη μέθοδος για τον υπολογισμό της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης είναι η επισήμανση των νουκλεϊκών οξέων, επιτρέποντας την παρακολούθηση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσής τους. Ορισμένες άλλες προσεγγίσεις όπως η κηλίδωση Western, η ανοσοχρώση και οι λειτουργικές δοκιμασίες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης. Εφόσον η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εξαρτάται από πολλαπλές πειραματικές παραμέτρους, ο προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης είναι το κλειδί για τον προσδιορισμό της επίδρασης διαφόρων παραγόντων στη διαμόλυνση.

Βασικές περιοχές που καλύπτονται

1. Ποιες είναι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της απόδοσης διαμόλυνσης
     – Συστήματα αναφοράς
2. Πώς να υπολογίσετε την αποτελεσματικότητα της διαμόλυνσης
     – Καταμέτρηση κελιών

Βασικοί όροι:κυτταρομετρία ροής, GFP, επισήμανση νουκλεϊκών οξέων, σύστημα αναφοράς, αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης

Ποιες είναι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της απόδοσης διαμόλυνσης

Χρησιμοποιούνται διαφορετικοί τύποι μεθόδων για τον υπολογισμό της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης.

1. Συστήματα Reporter

– Πράσινη πρωτεΐνη φθορισμού (GFP) – Το GFP βρίσκεται φυσικά στις μέδουσες. Χρησιμοποιείται τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση επιμολυσμένων κυττάρων με ταυτόχρονη επιμόλυνση του γονιδίου GFP με το γονίδιο ενδιαφέροντος. Η ποιοτική ανάλυση μπορεί να γίνει με μικροσκόπιο φθορισμού. Η ποσοτική ανάλυση μπορεί να γίνει με κυτταρομετρία ροής. Εκτός από το GFP, η κόκκινη πρωτεΐνη φθορισμού (RFP) και η κίτρινη πρωτεΐνη φθορισμού (YFP) μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως ανταποκριτές. Ε. coli αποικίες που εκφράζουν φθορίζουσες πρωτεΐνες φαίνονται στο σχήμα 1 .

Εικόνα 1:Φθορίζουσες πρωτεΐνες

• Λουσιφεράση – Η λουσιφεράση βρίσκεται φυσικά στις πυγολαμπίδες, παράγοντας φως. Οι αναλύσεις λουσιφεράσης είναι εξαιρετικά ευαίσθητες και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτική ανάλυση του επιμολυσμένου DNA.
• Βήτα-γαλακτοσιδάση – Η βήτα-γαλακτοσιδάση βρίσκεται στο E. coli . Χρησιμοποιείται στην ποιοτική ανάλυση που γίνεται με X-gal και στην ποσοτική ανάλυση που γίνεται με χρωματομετρικές, φθορίζουσες ή χημειοφωταύγιες μεθόδους.
• Εκκρινόμενη αλκαλική φωσφατάση (SEAP) – Το SEAP είναι ένας θερμοσταθερός ανταποκριτής, ο οποίος εκκρίνεται από κύτταρα θηλαστικών όταν εκφράζεται.

2. Σήμανση νουκλεϊκού οξέος – Στην επιμόλυνση μπορούν να χρησιμοποιηθούν πλασμίδια επισημασμένα με φθορισμό. Στη συνέχεια, μπορούν να μετρηθούν σε μικροσκόπιο φθορισμού.

3. Western blotting, ανοσοχρώση και άλλες λειτουργικές δοκιμασίες

Πώς να Υπολογίσετε την Απόδοση Transfection

Ο αριθμός των κυττάρων που εμφανίζουν τον ανταποκριτή και ο αριθμός των κυττάρων που δεν εμφανίζουν τον ανταποκριτή μπορούν να μετρηθούν σε μικροσκόπιο ή με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν τον ανταποκριτή δίνει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Εικόνα 2:Αποδοτικότητα διαμόλυνσης

Συμπέρασμα

Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης μπορεί να υπολογιστεί προσδιορίζοντας τον αριθμό των κυττάρων που εμφανίζουν επιμολυσμένο DNA σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων στο δείγμα. Ο αριθμός των κυττάρων μπορεί να υπολογιστεί κάτω από το μικροσκόπιο ή με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αναφοράς.

Αναφορά:

1. «Μέτρηση της αποτελεσματικότητας διαμόλυνσης». Mirus Bio LLC , Διαθέσιμο εδώ.

Εικόνα Ευγενική προσφορά:

1. «Ε. coli που εκφράζει φθορίζουσες πρωτεΐνες» Από Erin Rod – Δική εργασία, (CC BY-SA 4.0) μέσω Commons Wikimedia