Τι είναι η ηλεκτροφόρηση γέλης; Πώς και γιατί είναι χρήσιμο;

Η ηλεκτροφόρηση γέλης είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων με βάση το φορτίο και το μέγεθος στη βιολογία. Αυτός ο διαχωρισμός αποτελεί τη βάση πολλών βιολογικών πειραμάτων.

Συχνά διαβάζουμε για επιστήμονες που εργάζονται με DNA, εξάγουν DNA από διαφορετικά δείγματα, τα χειρίζονται, τα ενώνουν, τα κόβουν σε μικρότερα κομμάτια, χρησιμοποιούν ένζυμα και ούτω καθεξής. Η προϋπόθεση για όλες αυτές τις τεχνικές είναι να είναι σε θέση να απεικονίσει με ακρίβεια το DNA.

Έχετε αναρωτηθεί ποτέ πώς οι επιστήμονες είναι σε θέση να οραματιστούν το μικροσκοπικό μόριο DNA; Λοιπόν, η απάντηση είναι "ηλεκτροφόρηση".

Αυτή είναι μια μέθοδος διαχωρισμού φορτισμένων βιομορίων όπως το DNA, το RNA και οι πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας ηλεκτρισμό. Ο Arne Tiselius χρησιμοποίησε ηλεκτροφόρηση για να διαχωρίσει βιολογικά μόρια για πρώτη φορά το 1931. Παρόλο που έχει περάσει σχεδόν ένας αιώνας, η τεχνική της ηλεκτροφόρησης εξακολουθεί να είναι μια σημαντική τεχνική και ο μόνος τρόπος διαχωρισμού πολύπλοκων βιομορίων.

Ποια είναι η αρχή πίσω από αυτήν την τεχνική;

Η κύρια αρχή πίσω από την «ηλεκτροφόρηση» είναι η χρήση ηλεκτρισμού για τον διαχωρισμό των βιομορίων με βάση το φορτίο και το μέγεθός τους . Ο διαχωρισμός βασίζεται στο απλό γεγονός—"Όπως τα φορτία απωθούν το ένα το άλλο και τα αντίθετα φορτία ελκύονται το ένα".

Τα περισσότερα βιομόρια είναι φορτισμένα είτε θετικά είτε αρνητικά. Το DNA και το RNA έχουν αρνητικό φορτίο λόγω των φωσφορικών ομάδων που υπάρχουν στη δομή τους, ενώ οι πρωτεΐνες μπορεί να είναι είτε θετικές είτε αρνητικές, ανάλογα με τα αμινοξέα που τις αποτελούν.

Εάν αυτός ο διαχωρισμός γίνεται σε μέσο ζελέ, συνήθως κατασκευασμένο από αγαρόζη (πολυμερές υδατάνθρακα), ονομάζεται ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.

Τι είναι το gel στην ηλεκτροφόρηση γέλης;

Η γέλη στην ηλεκτροφόρηση γέλης αναφέρεται στη μήτρα στην οποία διαχωρίζονται τα βιομόρια. Είναι διαυγές και μοιάζει με ζελέ, όπως η ζελατίνη που καταναλώνουμε ως τροφή.

Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μήτρα για ηλεκτροφόρηση είναι ο πολυσακχαρίτης αγαρόζη. Ίσως αναρωτιέστε γιατί χρησιμοποιείται η αγαρόζη σε αυτή την τεχνική και υπάρχουν δύο λόγοι. Το ένα είναι η ικανότητά του να σχηματίζει πλέγμα (διασταυρούμενη σύνδεση). Η μήτρα της αγαρόζης λειτουργεί ως κόσκινο ή πλέγμα, μέσω του οποίου τα βιομόρια μπορούν εύκολα να ταξιδέψουν, ανάλογα με το μέγεθός τους. Ο δεύτερος λόγος είναι η ουδέτερη φύση του, που διασφαλίζει ότι δεν υπάρχει αντίδραση μεταξύ της αγαρόζης και των βιομορίων που πρόκειται να διαχωριστούν, ελαχιστοποιώντας έτσι τις πιθανότητες ψευδών αποτελεσμάτων.

Ας δούμε τη ρύθμιση της ηλεκτροφόρησης γέλης για να καταλάβουμε πώς γίνεται ο διαχωρισμός.

Το διάγραμμα δείχνει ένα σύστημα ηλεκτροφόρησης με κάθοδο και άνοδο τοποθετημένα σε διάλυμα ηλεκτρολύτη (ρυθμιστικό διάλυμα). Τα φρεάτια δειγμάτων χρησιμοποιούνται για τη φόρτωση των βιολογικών δειγμάτων που πρόκειται να διαχωριστούν. (Φωτογραφία:M. PATHAWEE/Shutterstock)

Το σύστημα είναι μια μικρή δεξαμενή με δύο ηλεκτρόδια - μια άνοδο (θετικά φορτισμένη) και μια κάθοδο (αρνητικά φορτισμένη) - βουτηγμένα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα είναι συχνά ένας ηλεκτρολύτης, ένα διάλυμα που μπορεί να μεταφέρει ηλεκτρισμό.

Το πήκτωμα βυθίζεται στο ρυθμιστικό διάλυμα. Διαθέτει μικρά φρεάτια στα οποία μπορεί να φορτωθεί το δείγμα. Τα φρεάτια δείγματος βρίσκονται κοντά στο αρνητικό ηλεκτρόδιο, έτσι ώστε τα αρνητικά φορτισμένα δείγματα να μετακινούνται στο θετικό ηλεκτρόδιο όταν είναι ενεργοποιημένη η παροχή ρεύματος.

Η επαναλαμβανόμενη μονάδα αγαρόζης, αποτελείται από D-γαλακτόζη (ένα σάκχαρο) και 3,6-άνυδρο L-γαλακτόζη (ένα τροποποιημένο σάκχαρο). (Φωτογραφία:Wikimedia commons)

Τα βιομόρια κινούνται μέσα στο τζελ με βάση το φόρτισή τους και μέγεθος . Τα αρνητικά φορτισμένα βιομόρια κινούνται προς το θετικό τερματικό και αντίστροφα.

Τα μικρότερα θραύσματα έχουν συχνά χαμηλό μοριακό βάρος, που σημαίνει ότι είναι ελαφρύτερα. Αυτό τους επιτρέπει να ταξιδεύουν γρήγορα μέσα από το τζελ, καλύπτοντας μεγαλύτερη απόσταση. Αντίθετα, τα μεγαλύτερα θραύσματα έχουν μεγαλύτερο μοριακό βάρος, επομένως κινούνται αργά μέσα στο πήκτωμα, καθώς το μέγεθος των πόρων της αγαρόζης δεν θα επιτρέψει στα μεγαλύτερα μόρια να κινηθούν πιο γρήγορα.

Η κίνηση βασίζεται επίσης στο ποσοστό αγαρόζης που χρησιμοποιείται στο τζελ. Τα πηκτώματα αγαρόζης χαμηλού ποσοστού έχουν μεγαλύτερα μεγέθη πόρων για να διευκολύνουν την ταχεία κίνηση μεγαλύτερων μορίων. Για τον διαχωρισμό μικρότερων μορίων DNA, ένα υψηλότερο ποσοστό γέλης αγαρόζης είναι καλύτερο, καθώς το μικρότερο μέγεθος πόρων μπορεί να προσφέρει καλύτερο διαχωρισμό.

Το διάγραμμα δείχνει πώς ένα μείγμα μορίων διαφορετικών μεγεθών κινείται μέσα από μια γέλη αγαρόζης. Τα μικρότερα μόρια διανύουν τη μεγαλύτερη απόσταση, ενώ τα μεγαλύτερα μόρια ταξιδεύουν λιγότερο. (Φωτογραφία :M. Tali Lavy/Shutterstock)

Πώς να οπτικοποιήσετε το DNA

Αν δούμε το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης, τη γέλη αγαρόζης ή τα δείγματα DNA, είναι όλα διαφανή. Λοιπόν, πώς οπτικοποιούμε το DNA; Χρησιμοποιούμε έγχρωμη βαφή που συνδέεται με το DNA ή τα βιομόρια. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη βαφή σύνδεσης DNA είναι το βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) .

Η χρωστική είτε προστίθεται στο πήκτωμα αγαρόζης είτε στο ρυθμιστικό διάλυμα που είναι γεμάτο στη συσκευή. Είτε έτσι είτε αλλιώς, θα πρέπει να έρθει σε επαφή με το DNA και να συνδεθεί σε αυτό.

Με την προσθήκη αυτής της χρωστικής, το πήκτωμα εκτίθεται στο υπεριώδες φως (UV). Υπό το υπεριώδες φως, το βρωμιούχο αιθίδιο απελευθερώνει ένα έντονο φως. Καθώς το αιθίδιο είναι ήδη συνδεδεμένο με το DNA, τα σημεία στο πήκτωμα που φαίνονται φωτεινά είναι τα σημεία όπου μπορεί να βρεθεί το DNA.

Κάποιος πρέπει πάντα να λαμβάνει προφυλάξεις κατά το χειρισμό του EtBr, καθώς είναι καρκινογόνος (καρκινογόνος). Πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή και να απορρίπτεται σωστά.

Το DNA θα φαίνεται ως φωτεινές μικρές κάθετες γραμμές, που ονομάζονται ζώνες, σε σκούρο φόντο. Κάθε ζώνη αποτελείται από μόρια DNA του ίδιου μεγέθους. Οι άθικτες ζώνες υποδεικνύουν DNA καλής ποιότητας. Εάν το DNA είναι χαμηλής ποιότητας ή έχει μολυντές, η ζώνη του DNA δεν θα είναι άθικτη, αλλά θα απλωθεί, που ονομάζεται επίχρισμα.

Αν θέλουμε να προσδιορίσουμε το μέγεθος ή το μοριακό βάρος του DNA, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τις σκάλες DNA, που είναι δείγματα DNA γνωστών μεγεθών που διατίθενται στο εμπόριο. Εάν φορτώσουμε τη σκάλα DNA μαζί με το δείγμα DNA (του οποίου το μοριακό βάρος είναι άγνωστο), η απόσταση που μετανάστευσαν και τα δύο δείγματα DNA μπορεί να συγκριθεί για να προσδιοριστεί το μοριακό βάρος του δείγματος DNA.

Η εικόνα απεικονίζει ολόκληρη τη διαδικασία ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης. Τα δείγματα προστίθενται στα φρεάτια μιας γέλης αγαρόζης που διατηρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα και συνδέεται με την παροχή ρεύματος. Αφού το δείγμα έχει ταξιδέψει στο πήκτωμα, απεικονίζεται υπό υπεριώδη ακτινοβολία για να προσδιοριστεί η ποιότητα και η ποσότητα του DNA. (Φωτογραφία:Soleil Nordic/Shutterstock)

Ποιοι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν τη μετανάστευση DNA στο πήκτωμα;

Διάφοροι παράγοντες θα επηρεάσουν τον τρόπο με τον οποίο το DNA μπορεί να μεταναστεύσει μέσα στο πήκτωμα. Υπάρχει αντίστροφη σχέση μεταξύ του μεγέθους του μορίου του DNA και της συγκέντρωσης της αγαρόζης που χρησιμοποιείται. μεγαλύτερο DNA απαιτεί μικρότερες συγκεντρώσεις αγαρόζης και αντίστροφα.

Εξαρτάται επίσης από την τάση που εφαρμόζεται. Τα δείγματα κινούνται πιο γρήγορα υπό υψηλή τάση, αλλά οι ζώνες DNA δεν θα παραμείνουν ανέπαφες. Μια χαμηλότερη τάση θα έχει ως αποτέλεσμα την πιο αργή μετανάστευση του DNA, αλλά οι ζώνες θα είναι διακριτές. Επομένως, μπορεί να χρειαστεί να συμβιβαστεί κανείς μεταξύ του χρόνου και της τάσης για τον σωστό διαχωρισμό του DNA.

Η παρουσία EtBr, η ποιότητα της αγαρόζης και το pH και η σύνθεση του ρυθμιστικού που χρησιμοποιείται επηρεάζουν επίσης την κινητικότητα του DNA.

Μια τελευταία λέξη

Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης είναι η βασική και πιθανώς η μόνη τεχνική για τον προσδιορισμό της ποιότητας και του μεγέθους των νουκλεϊκών οξέων σε διάφορους τομείς της βιολογικής έρευνας. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες σημειώθηκε μια σαρωτική περίοδος εξέλιξης και ανάπτυξης στην τεχνική, καθώς και μια επέκταση των περιπτώσεων όπου μπορεί να χρησιμοποιηθεί.