Γιατί οι αλκαλικές συνθήκες χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση;
Οι αλκαλικές συνθήκες (συνήθως γύρω από το ρΗ 8,0 έως 9,5) προτιμώνται στην ηλεκτροφόρηση για τον διαχωρισμό θραυσμάτων DNA επειδή βελτιώνουν την ανάλυση και τον διαχωρισμό των μορίων DNA. Στο αλκαλικό ρΗ, η ραχοκοκαλιά του DNA γίνεται πιο αρνητικά φορτισμένη λόγω της αποπρωτονίωσης των φωσφορικών ομάδων. Αυτό το αυξημένο αρνητικό φορτίο ενισχύει την ηλεκτροφορητική κινητικότητα των μορίων ϋΝΑ, επιτρέποντας τον καλύτερο διαχωρισμό με βάση το μέγεθος.
2. Μονόκλωνο ϋΝΑ:
Οι αλκαλικές συνθήκες προάγουν τη μετουσίωση του διπλού κλώνου DNA σε μονόκλωνο DNA. Τα μόριο μονούκλωνου ϋΝΑ έχουν ένα πιο ομοιόμορφο σχήμα και μέγεθος σε σύγκριση με το διπλό έλικες DNA, το οποίο διευκολύνει τον διαχωρισμό τους κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης.
3. Σταθερότητα πηκτής:
Τα αλκαλικά ρυθμιστικά συμβάλλουν στη σταθερότητα των πηκτωμάτων αγαρόζης που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση. Οι πηκτές αγαρόζης τείνουν να λιώσουν σε υψηλότερες θερμοκρασίες και οι αλκαλικές καταστάσεις συμβάλλουν στη διατήρηση της ακεραιότητάς τους κατά τη διάρκεια των διαδρομών ηλεκτροφόρησης, εμποδίζοντας την παραμόρφωση του πηκτώματος.
4. Δέσμευση βρωμιούχου Ethidium:
Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια συνήθως χρησιμοποιούμενη φθορίζουσα βαφή για την απεικόνιση του DNA σε πηκτώματα ηλεκτροφόρησης. Υπό αλκαλικές συνθήκες, το βρωμίδιο αιθιδίου δεσμεύεται πιο αποτελεσματικά σε μονόκλωνο DNA, ενισχύοντας την ένταση φθορισμού και καθιστώντας τις ζώνες DNA πιο ορατές.
5. Πρόληψη κατακερματισμού DNA:
Οι αλκαλικές συνθήκες ελαχιστοποιούν τη δραστικότητα των DNases, οι οποίες είναι ένζυμα που μπορούν να υποβαθμίσουν το DNA. Το υψηλό ρΗ αναστέλλει τη δραστικότητα αυτών των ενζύμων, διατηρώντας την ακεραιότητα των θραυσμάτων ϋΝΑ κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης.
Συνολικά, οι αλκαλικές συνθήκες στην ηλεκτροφόρηση παρέχουν καλύτερη ανάλυση, βελτιωμένο διαχωρισμό του DNA, σταθερότητα πηκτής, βελτιωμένη δέσμευση βρωμιούχου αιθιδίου και προστασία από την αποικοδόμηση του DNA, καθιστώντας τους την προτιμώμενη επιλογή για την ανάλυση της ανάλυσης και του διαχωρισμού του DNA.
