Αλληλουχία DNA:Ορισμός και συχνές ερωτήσεις

Αλληλουχία DNA 

Έχετε ακούσει ποτέ για την αλληλουχία DNA; Για παράδειγμα, η αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος ολοκληρώθηκε το 2003, μετά από χρόνια διεθνών προσπαθειών. Τι σημαίνει όμως η αλληλούχιση ενός γονιδιώματος ή ακόμα και ενός μικρού θραύσματος DNA;

Τι είναι η αλληλουχία DNA;

Η αλληλουχία DNA είναι η αναγνώριση της αλληλουχίας των βάσεων των νουκλεοτιδίων σε ένα κομμάτι DNA. Με άλλα λόγια, ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA σημαίνει την εύρεση της αλληλουχίας των τεσσάρων θεμελιωδών δομικών στοιχείων του DNA - γνωστών ως «βάσεις» - που σχηματίζουν το μόριο του DNA. Η αλληλουχία ενημερώνει τους επιστήμονες για το είδος της γενετικής πληροφορίας που μεταφέρεται σε ένα συγκεκριμένο τμήμα του DNA. Ας υποθέσουμε ότι οι επιστήμονες μπορούν να χρησιμοποιήσουν πληροφορίες αλληλουχίας για να ανακαλύψουν ποιες εκτάσεις DNA φέρουν γονίδια και ποιες διατάσεις περιέχουν ρυθμιστικές οδηγίες που χρησιμοποιούνται για την ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση γονιδίων. Επιπλέον, και είναι σημαντικό, τα δεδομένα αλληλουχίας μπορούν να τονίσουν αλλαγές σε ένα γονίδιο που μπορεί να οδηγήσουν σε ασθένεια.

Στη δομή της διπλής έλικας του DNA, οι τέσσερις βάσεις του DNA ζευγαρώνουν πάντα με την ίδια για να δώσουν «ζεύγη βάσεων». Η αδενίνη (Α) ζευγαρώνει με τη θυμίνη (Τ) και η κυτοσίνη (C) με τη γουανίνη (G). Αυτό το ζευγάρωμα είναι θεμελιώδες για τη μέθοδο με την οποία τα μόρια του DNA αντιγράφονται όταν συμβαίνει κυτταρική διαίρεση. Η σύζευξη είναι επίσης θεμελιώδης για τις μεθόδους με τις οποίες εκτελούνται τα περισσότερα πειράματα που σχετίζονται με την αλληλουχία DNA. Το ανθρώπινο γονιδίωμα φέρει δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων που δίνουν τις οδηγίες για τη δημιουργία και τη διατήρηση της μορφής ενός ανθρώπου.

Σήμερα, με τον κατάλληλο εξοπλισμό και υλικά, έχει καταστεί δυνατή η αλληλούχιση ενός μικρού τμήματος διαγραμμάτων αλληλουχίας DNA. Ωστόσο, η αλληλούχιση ενός ολόκληρου γονιδιώματος (όλου του DNA ενός οργανισμού) παραμένει μια πρόκληση. Περιλαμβάνει το σπάσιμο του διαγράμματος αλληλουχίας DNA του γονιδιώματος σε πολλά μικρότερα θραύσματα, την αλληλουχία των τεμαχίων και τη διάταξη των αλληλουχιών σε μια ενιαία μεγάλη «συναίνεση». Χάρη στις σύγχρονες μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί τις τελευταίες δεκαετίες, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του γονιδιώματος είναι πλέον πολύ πιο γρήγορος και λιγότερο δαπανηρός από ό,τι ήταν κατά τη διάρκεια του Έργου Ανθρώπινου Γονιδιώματος.

Σε αυτή τη συζήτηση, θα ρίξουμε μια ματιά στις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Θα επικεντρωθούμε σε μια αξιόπιστη μέθοδο, την αλληλούχιση Sanger, αλλά θα συζητήσουμε επίσης νέες μεθόδους ("επόμενης γενιάς") που μείωσαν το κόστος και επιτάχυναν την ταχύτητα της αλληλουχίας DNA μεγάλης κλίμακας.

Sanger sequencing:Η μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας

Η αλληλουχία Sanger είναι μια τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που χρησιμοποιείται συνήθως για την αλληλουχία θραυσμάτων ενός διαγράμματος αλληλουχίας DNA που έχει περίπου 900 ζεύγη βάσεων. Ονομάζεται επίσης μέθοδος τερματισμού της αλυσίδας και αναπτύχθηκε το 1977 από τον επιστήμονα από τη Βρετανία Fred Sanger και τους συνεργάτες του.

Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger χρησιμοποιήθηκε για να ανακαλύψει τις αλληλουχίες πολλών μικρών θραυσμάτων DNA ανθρώπων στο έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αυτά τα θραύσματα δεν ήταν απαραίτητα 900 ζεύγη βάσεων ή χαμηλότερα, αλλά οι επιστήμονες μπορούσαν να αποκρυπτογραφήσουν κάθε θραύσμα με τη χρήση πολλαπλών γύρων αλληλουχίας Sanger. Τα μέρη του DNA παρατάχθηκαν σύμφωνα με τα μέρη που συμπίπτουν για να αποκρυπτογραφήσουν τις αλληλουχίες μεγαλύτερων τμημάτων DNA και, τέλος, ολόκληρου του χρωμοσώματος.

Παρόλο που τώρα η αλληλουχία των γονιδιωμάτων γίνεται γενικά με άλλες ταχύτερες και οικονομικά ευνοϊκές μεθόδους, η αλληλουχία Sanger εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό αλληλουχίας μεμονωμένων τεμαχίων DNA, όπως θραύσματα που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση DNA ή δημιουργούνται μέσω PCR.

Συστατικά για την αλληλουχία Sanger

Η αλληλουχία Sanger απαιτεί τη δημιουργία αναρίθμητων αντιγράφων μιας περιοχής στόχου του DNA. Έχει συστατικά που είναι τα ίδια με εκείνα που απαιτούνται για την αντιγραφή του DNA σε ή για την PCR, η οποία αντιγράφει το DNA in vitro. Περιλαμβάνουν:

• Ένα ένζυμο που ονομάζεται πολυμεράση DNA
• Ένας εκκινητής είναι ένα σύντομο θραύσμα μονόκλωνου DNA που συνδέεται με το πρότυπο DNA και λειτουργεί σαν αρχάριος για την πολυμεράση.
• Τα τέσσερα νουκλεοτίδια DNA.
• Το DNA που πρέπει να υποβληθεί σε προσδιορισμό αλληλουχίας
• Μια αντίδραση προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger αποτελείται επίσης από ένα συγκεκριμένο συστατικό—το Διδεοξυ, εκδόσεις τεσσάρων νουκλεοτιδίων, το καθένα σημασμένο με μια βαφή διαφορετικού χρώματος.

Αυτά τα νουκλεοτίδια είναι παρόμοια με τα κανονικά νουκλεοτίδια, αλλά με μια βασική διαφορά:δεν υπάρχει ομάδα υδροξυλίου στον άνθρακα στο 3' άκρο του δακτυλίου ζάχαρης. Σε ένα κανονικό νουκλεοτίδιο, η ομάδα υδροξυλίου στο άκρο 3' λειτουργεί ως "άγκιστρο", παρέχοντας πρόσβαση σε ένα νέο νουκλεοτίδιο που πρέπει να προστεθεί σε μια προϋπάρχουσα αλυσίδα.

Αφού προστεθεί ένα διδεοξυ νουκλεοτίδιο στην αλυσίδα, δεν υπάρχει διαθέσιμο υδροξύλιο και δεν μπορούν να προστεθούν άλλα νουκλεοτίδια. Η αλυσίδα τελειώνει με το διδεοξυ νουκλεοτίδιο, που επισημαίνεται με ένα συγκεκριμένο χρώμα βαφής με βάση τη βάση (A, T, C ή G) που φέρει.

Μέθοδος αλληλουχίας Sanger

Το δείγμα DNA που πρόκειται να προσδιοριστεί η αλληλουχία αναμιγνύεται σε ένα σωλήνα με εκκινητή, DNA πολυμεράση και νουκλεοτίδια. Τα τέσσερα σημασμένα με βαφή, τερματικά διδεοξυ νουκλεοτίδια αλυσίδας συνδυάζονται επίσης με αυτό, αλλά σε μικρότερες ποσότητες από τα συνηθισμένα νουκλεοτίδια.

Πρώτον, το μίγμα υποβάλλεται σε υψηλές θερμοκρασίες για να προκαλέσει μετουσίωση της αλληλουχίας DNA του εκμαγείου και να αποσπάσει τους κλώνους. Στη συνέχεια, η θερμοκρασία του μειώνεται έτσι ώστε το αστάρι να μπορεί να συνδεθεί με το μονόκλωνο πρότυπο. Η θερμοκρασία αυξάνεται ξανά μετά τη σύνδεση του εκκινητή, επιτρέποντας στην πολυμεράση DNA να παράγει νέο DNA ξεκινώντας από τον εκκινητή. Η DNA πολυμεράση συνεχίζει να προσθέτει νουκλεοτίδια στην αλυσίδα μέχρι να προστεθεί ένα διδεοξυνουκλεοτίδιο αντί για ένα κανονικό. Μετά από αυτό, δεν μπορούν να προστεθούν άλλα νουκλεοτίδια και ο κλώνος συμπληρώνεται με το διδεοξυ νουκλεοτίδιο.

Αυτή η διαδικασία επαναλαμβάνεται ξανά και ξανά σε αρκετούς κύκλους. Όταν ολοκληρωθεί ο κύκλος, είναι πρακτικά εγγυημένο ότι ένα διδεοξυ νουκλεοτίδιο θα έχει συνδεθεί σε κάθε θέση της συμπληρωματικής αλληλουχίας DNA στόχου σε τουλάχιστον μία αντίδραση. Αυτό σημαίνει ότι ο σωλήνας θα έχει θραύσματα διαφορετικού μήκους, που κλείνουν σε κάθε θέση νουκλεοτιδίου στην αρχική συμπληρωματική αλληλουχία DNA. Τα άκρα των θραυσμάτων θα επισημαίνονται με βαφές που προσδιορίζουν το τελικό τους νουκλεοτίδιο.

Αλληλουχία επόμενης γενιάς

Αν αναρωτιέστε ότι το όνομα ακούγεται σαν Star Trek, έτσι λέγεται! Το πιο σύγχρονο σύνολο τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας DNA ονομάζεται συλλογικά προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς.

Είναι διαθέσιμη μια ποικιλία τεχνικών αλληλούχισης επόμενης γενιάς που χρησιμοποιούν διαφορετικές τεχνολογίες. Ωστόσο, τα περισσότερα από αυτά έχουν κοινά χαρακτηριστικά που τα διαφοροποιούν από την αλληλουχία Sanger:

Πολύ παράλληλη :πολλές αντιδράσεις αλληλουχίας συμβαίνουν ταυτόχρονα

Μικροκλίμακα :οι αντιδράσεις είναι μικροσκοπικές και πολλές μπορούν να εκτελεστούν ταυτόχρονα σε ένα τσιπ

Γρήγορα :επειδή οι αντιδράσεις εκτελούνται παράλληλα, τα αποτελέσματα είναι έτοιμα πολύ πιο γρήγορα

Χαμηλό κόστος :ο προσδιορισμός της αλληλουχίας ενός γονιδιώματος είναι λιγότερο δαπανηρός από τον προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger

Μικρότερο μήκος :οι αναγνώσεις κυμαίνονται συνήθως από 50-700

νουκλεοτίδια σε μήκος

Αναπτύσσονται νέες τεχνολογίες αλληλουχίας;

Μια νέα τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας περιλαμβάνει την παρατήρηση μορίων πολυμεράσης DNA καθώς αντιγράφουν το DNA (τα ίδια μόρια που δημιουργούν νέα αντίγραφα DNA στα κύτταρά μας) με μια πολύ γρήγορη και αποτελεσματική κάμερα και μικροσκόπιο ταινιών και την ενσωμάτωση διαφορετικών φωτεινών χρωμάτων διαφορετικών χρωμάτων, μία για τα γράμματα A, T, C και G. Αυτή η μέθοδος παρέχει διαφορετικές και πολύ χρήσιμες πληροφορίες από αυτές που παρέχονται από τα συστήματα οργάνων που χρησιμοποιούνται πιο συχνά.

Μια άλλη σύγχρονη τεχνολογία που βρίσκεται σε εξέλιξη περιλαμβάνει τη χρήση νανοπόρων για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, η οποία περιλαμβάνει τη διοχέτευση μονού κλώνων του προσδιοριστή αλληλουχίας DNA μέσω εξαιρετικά μικρών μεμβρανωδών πόρων. Οι βάσεις των συμπληρωματικών αλληλουχιών DNA περνούν μία κάθε φορά καθώς συμπιέζονται μέσω του νανοπόρου. Οι βάσεις επισημαίνονται με εκτίμηση των διαφορών στη συνέπειά τους στα ιόντα και στο ρεύμα που ρέει μέσω του πόρου. Η χρήση νανοπόρου για τα προφίλ DNA που χρησιμοποιούν η αλληλουχία DNA προσφέρει πολλά πιθανά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις τρέχουσες τεχνικές. Ο στόχος είναι να μειωθεί το κόστος της αλληλουχίας και να γίνει πιο γρήγορα. Σε αντίθεση με τις τρέχουσες μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας, τα προφίλ DNA νανοπόρου χρησιμοποιούν αλληλουχία DNA για να εξασφαλίσουν ότι οι ερευνητές μπορούν να μελετήσουν το ίδιο μόριο επανειλημμένα.

Συμπέρασμα 

Αν και τα προφίλ ρουτίνας DNA που χρησιμοποιούν την αλληλουχία DNA στο ιατρείο είναι ακόμα ένα τραβηγμένο όνειρο, ορισμένα μεγάλα ιατρικά κέντρα έχουν αρχίσει να χρησιμοποιούν την αλληλουχία για τη διάγνωση και τη θεραπεία ορισμένων ιατρικών καταστάσεων. Για παράδειγμα, σε περιπτώσεις καρκίνου, οι γιατροί χρησιμοποιούν προοδευτικά δεδομένα αλληλουχίας για να προσδιορίσουν τον συγκεκριμένο τύπο καρκίνου που έχει ένας ασθενής. Αυτό δίνει τη δυνατότητα στον ιατρό να κάνει καλύτερες επιλογές θεραπείας. Η διαφοροποίηση των αλληλουχιών του γονιδιώματος διαφόρων τύπων ζώων και οργανισμών, όπως ζυμομύκητες και χιμπατζήδες, μπορεί επίσης να δώσει πληροφορίες για τη βιολογία της ανάπτυξης και της εξέλιξης.

Συχνές ερωτήσεις

1. Πόσο νέα είναι η αλληλουχία DNA;

Μετά την εκτέλεση του Έργου Ανθρώπινου Γονιδιώματος, οι τεχνολογικές εξελίξεις έχουν ενισχύσει την ταχύτητα και έχουν μειώσει το κόστος σε σημείο όπου τα μεμονωμένα γονίδια μπορούν να αλληλουχούνται τακτικά. Μερικά εργαστήρια μπορούν ακόμη και να αλληλουχούν πάνω από 100.000 δισεκατομμύρια βάσεις ετησίως και ένα πλήρες γονιδίωμα μπορεί να αναλυθεί για μερικές χιλιάδες δολάρια.

2. Ποια είναι η σημασία της αλληλουχίας DNA για την ανθρώπινη υγεία;

Οι ερευνητές είναι πλέον σε θέση να διαφοροποιούν μεγάλες εκτάσεις αλληλουχίας DNA 1 εκατομμυρίου βάσεων ή περισσότερων από ξεχωριστά άτομα ταχύτερα και οικονομικά. Τέτοιες συγκρίσεις μπορούν να παρέχουν έναν τεράστιο όγκο πληροφοριών σχετικά με το ρόλο της κληρονομικότητας στην ευαισθησία σε ιατρικές καταστάσεις και στην ανταπόκριση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες. Επιπλέον, η ικανότητα αλληλουχίας του γονιδιώματος ταχύτερα και οικονομικά δημιουργεί τεράστιες δυνατότητες για διαγνωστικά και θεραπείες.

3. Ποιες είναι οι χρήσεις και οι περιορισμοί της αλληλουχίας Sanger;

Η αλληλουχία Sanger δείχνει μια αλληλουχία υψηλής ποιότητας για σχετικά μεγάλες εκτάσεις DNA (έως περίπου 900 ζεύγη βάσεων). Χρησιμοποιείται γενικά για την αλληλουχία μεμονωμένων κομματιών προσδιορισμού αλληλουχίας DNA, όπως πλασμίδια βακτηρίων ή DNA που αντιγράφεται σε PCR.

Οι περιορισμοί της αλληλουχίας Sanger, ωστόσο, είναι ότι είναι δαπανηρή και αναποτελεσματική για έργα μεγαλύτερης κλίμακας, για παράδειγμα, η αλληλούχιση ενός ολόκληρου γονιδιώματος ή μεταγονιδιώματος. Οι σύγχρονες, μεγάλης κλίμακας τεχνικές αλληλουχίας είναι πιο γρήγορες και λιγότερο δαπανηρές για τέτοιες εργασίες.