Ανίχνευση ζωονοσογόνων πρωτιστών σε ακατέργαστα λύματα για περιβαλλοντική παρακολούθηση
Παρόλο που η βιόσφαιρα είναι κατά κύριο λόγο μικροβιακή, το μεγαλύτερο μέρος του μικροβιακού κόσμου εξακολουθεί να είναι terra incognita . Αλλά αυτό αλλάζει. Η μεταγονιδιωματική και η μικροβιωμική - καταλογισμοί μικροβίων που ελήφθησαν δειγματοληπτικά από το περιβάλλον και τον άνθρωπο, με βάση την αλληλουχία, αντιστοίχως - έχουν δει μια έκρηξη έρευνας και δημοσιότητας την τελευταία δεκαετία. Ωστόσο, επικεντρώνονται κυρίως στα βακτήρια. Οι Protists — μια λέξη που δεν λείπει καθόλου, για την ποικιλόμορφη σειρά μονοκύτταρων ευκαρυωτών που βρίσκονται σχεδόν σε όλα τα υγρά περιβάλλοντα — έχουν λάβει πολύ λιγότερη προσοχή, παρά το γεγονός ότι είναι πανταχού παρόντες, οικολογικά σημαντικοί και επίσης σημαντικοί ιατρικά.
Για παράδειγμα, τα φωτοσυνθετικά πρωτεία, όπως τα πράσινα φύκια, είναι από τους κύριους παραγωγούς οξυγόνου της Γης και αποτελούν τη βάση των υδρόβιων τροφικών αλυσίδων. Τα μη φωτοσυνθετικά αντίστοιχά τους, όπως η αμοιβάδα και το paramecium, είναι θεμελιώδη για τις υδρόβιες και χερσαίες τροφικές αλυσίδες, καθώς και ως θηρευτές βακτηρίων. Είναι επίσης κρίσιμοι αποικοδομητές της οργανικής ύλης, τόσο σε τρόπους ελεύθερης διαβίωσης όσο και ως αμοιβαίοι κάτοικοι ορισμένων εντέρων εντόμων όπου διασπούν την κυτταρίνη. Ορισμένα είδη πρωτίστων έχουν εξελίξει παρασιτικές, ακόμη και παθογόνες σχέσεις με τα φυτά και τα ζώα ξενιστές, με καταστροφικές συνέπειες για τη δημόσια υγεία και τις οικονομικές συνέπειες. Αυτά περιλαμβάνουν είδη που προκαλούν μάστιγα που γνωρίζουμε ως ελονοσία, διαρροϊκή νόσο, ασθένεια του ύπνου και λεϊσμανίαση, καθώς και λιγότερο θανατηφόρους αλλά κοινούς και εξουθενωτικούς παράγοντες όπως το εντερικό παράσιτο Giardia και το σεξουαλικά μεταδιδόμενο παράσιτο Trichomonas vaginalis. Ένας αριθμός παθογόνων πρωτιστών είναι επίσης ζωονοσογόνοι, που σημαίνει ότι μεταδίδονται από τα ζώα στον άνθρωπο – ένα χαρακτηριστικό με ανησυχητικές επιπτώσεις για τη δημόσια υγεία.
Ένας λόγος για τη σχετική παραμέληση των πρωτιστών στις έρευνες «-omic» είναι ότι σε αντίθεση με την εργασία που επικεντρώνεται στα βακτήρια, δεν υπάρχουν τυποποιημένα πρωτόκολλα και δείκτες για την ειδική ανάλυση του πρωτιστικού DNA σε ταξινομικά διαφορετικά δείγματα. Σε δείγματα μικροβιώματος, οι αλληλουχίες πρωτιστών πρέπει να διακρίνονται ανάμεσα σε συντριπτικές ποσότητες DNA ξενιστή και βακτηρίων. Σε μεταγονιδιωματικές έρευνες περιβαλλοντικών δειγμάτων, ανταγωνίζονται ομοίως για την προσοχή με αλληλουχίες από βακτήρια, ιούς, μύκητες, φυτά και ζώα. Ένα τέτοιο περιβάλλον είναι τα λύματα, μια δυνητικά χρήσιμη πηγή για την παρακολούθηση ζωονοσογόνων πρωτιστών που κυκλοφορούν όπου ζουν οι άνθρωποι. Αλλά η παραγωγή μιας ακριβούς εκτίμησης της ποικιλομορφίας τους στα ακατέργαστα λύματα είναι μια τρομερή πρόκληση.
Αλληλουχία Ζωονοσογόνων Πρωτοστατών σε ακατέργαστα λύματα
Σε μια πρόσφατη εργασία, ερευνητές στο Κέντρο Γονιδιωματικής και Βιολογίας Συστημάτων του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης ανέλαβαν αυτήν την πρόκληση. Ανέπτυξαν και βελτιστοποίησαν μια ροή εργασίας με βάση την αλληλουχία για την ανίχνευση πρωτιστών στα λύματα, εστιάζοντας ιδιαίτερα στα ζωονοσογόνα είδη. Πρώτον, αξιολόγησαν τη χρησιμότητα των «καθολικών» εκκινητών PCR για δύο μεταβλητές περιοχές V4 και V9 του 18S ριβοσωμικού RNA - που χρησιμοποιούνται συχνά σε μελέτες ευκαρυωτικής ποικιλομορφίας - για τον εντοπισμό πρωτιστών σε ένα γνωστό σύνολο μικτών ταξινομικών κατηγοριών. Για να δημιουργήσουν αυτήν την «ψευδή κοινότητα» ενίσχυσαν και ακολούθησαν τις περιοχές V4 και V9 από 23 είδη πρωτίστων, μυκήτων και σπονδυλωτών, συνδύασαν τις ακολουθίες σε ένα σύνολο και χρησιμοποίησαν τον αλγόριθμο ομαδοποίησης του πακέτου λογισμικού ανάλυσης μικροβιακής κοινότητας QIIME για να τις ομαδοποιήσουν τυφλά σε OTU (O λειτουργικό Τ αξονική U nits) από ομοιότητα. Το έκαναν αυτό για τις ακολουθίες V4 και V9 ξεχωριστά για σύγκριση, αποδίδοντας 20 και 18 OTU, αντίστοιχα.
Στη συνέχεια, τα OTU «ονομάστηκαν» αντιστοιχίζοντας τις αλληλουχίες τους με αλληλουχίες αναφοράς στη δημόσια βάση δεδομένων αλληλουχιών rRNA SILVA (η οποία αποδείχθηκε ότι χρειαζόταν επιμέλεια για τη διόρθωση και τη βελτίωση της κάλυψης της αλληλουχίας πρωτίστου). Τα ονόματα που εκχωρήθηκαν από το λογισμικό συγκρίθηκαν στη συνέχεια με τις πραγματικές, γνωστές πηγές των ακολουθιών σε κάθε OTU. Και τα 20 V4 OTU αναγνωρίστηκαν σωστά σε επίπεδο γένους και όλα εκτός από ένα αναγνωρίστηκαν σωστά σε επίπεδο είδους. Από τα 18 V9 OTU, τα 16 αναγνωρίστηκαν σωστά σε επίπεδο γένους, 11 σε επίπεδο είδους. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο περιοχές 18S rRNA ήταν ικανές να αναλύουν πρωτίστες, συχνά μέχρι το επίπεδο του είδους, μέσα σε ένα ταξινομικά ευρείας κλίμακας μείγμα αλληλουχιών.
Maritz et al . στη συνέχεια ενσωμάτωσε τους εκκινητές V4 και V9 στην ανάπτυξη ενός βελτιστοποιημένου αγωγού για πρωτοστατική έρευνα ακατέργαστων λυμάτων, χρησιμοποιώντας δείγματα από την εκροή ενός συγκροτήματος διαμερισμάτων στη Νέα Υόρκη. Ο αγωγός περιλαμβάνει βελτιστοποιημένα βήματα για συλλογή δειγμάτων, εξαγωγή DNA, προετοιμασία βιβλιοθήκης DNA 18S rRNA και V4 και V9, ανάλυση σε βάθος Illumina, επεξεργασία αναγνώσεων Illumina, δημιουργία OTU και ανάλυση ταξινόμησης και ποικιλομορφίας της κοινότητας. Μέσω δοκιμής και λάθους, βρήκαν ότι η εξαγωγή DNA την ίδια ημέρα από όγκους 1 ml φρέσκων, μη κατεψυγμένων λυμάτων, σε συνδυασμό με τη χρήση ενός εκκινητή αποκλεισμού σπονδυλωτών (ο οποίος, παραδόξως, εμπόδιζε επίσης αλληλουχίες ασπόνδυλων) κατά τη διάρκεια του σταδίου ενίσχυσης PCR, παρήγαγε το βέλτιστη ισορροπία της απόδοσης του DNA και του εύρους ανίχνευσης των πρωτιστών. Και τα δύο σετ εκκινητών V4 και V9 προτάθηκαν να χρησιμοποιηθούν σε ένα δείγμα, καθώς οι δυνάμεις ανίχνευσης αλληλεπικαλύπτονταν και αλληλοσυμπληρώνονταν.
Τα ελεύθερα βακτηρίδια που τρώνε βλεφαρίδες και τα μαστίγια βρέθηκαν να κυριαρχούν στο πρωτιστικό συστατικό των λυμάτων, αλλά υπογραφές DNA διαφόρων παρασιτικών, ζωονοσογόνων και δυνητικά παθογόνων πρωτιστών εντοπίστηκαν επίσης σε χαμηλότερα επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων εντερικών πρωτιστών από τριχομονάδα (Πεντατριχόμονας ), αμοιβοειδές (Entamoeba ), apicomplexan (Cryptosporidium ) και heterokont (Blastocystis ) γενεαλογίες, καθώς και μια τριχομονάδα πουλιών και το παράσιτο της γάτας/ανθρώπου Toxoplasma .
Είναι αλήθεια ότι πολλά OTU από ακατέργαστα λύματα δεν ταυτοποιήθηκαν, υποδεικνύοντας τα κενά που απομένουν στην ενημερωμένη βάση δεδομένων 18S, και από συμπέρασμα, στην αλληλουχία κάλυψης του μικροβιακού ευκαρυωτικού κόσμου. Οι έρευνες που βασίζονται στην αλληλουχία δεν μπορούν να μας πουν εάν οι οργανισμοί που ανιχνεύθηκαν ήταν ζωντανοί ή νεκροί, και αναγκαστικά είναι απλώς «στιγμιότυπα» πληθυσμών που πιθανώς αλλάζουν συχνά. Όμως οι μέθοδοι που χρησιμοποίησαν οι Maritz et al. υπόσχονται έναν βιώσιμο τρόπο παρακολούθησης των τάσεων του πληθυσμού των πρωταγωνιστών με την πάροδο του χρόνου στα λύματα – ένα πιθανό όφελος για τη δημόσια υγεία.
Αυτά τα ευρήματα περιγράφονται στο άρθρο με τίτλο An 18S rRNA Workflow for Characterizing Protists in Sewage, with a Focus on Zoonotic Trichomonads, που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Microbial Ecology . Επικεφαλής αυτής της εργασίας ήταν η Julia Maritz και η Jane Carlton από το Πανεπιστήμιο της Νέας Υόρκης.
