Ποιες είναι οι ακόλουθες αντιδράσεις που χρησιμοποιούνται για τη ραδιενεργή επισήμανση του DNA;
1. Μετάφραση Nick:
* αντίδραση: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί το ένζυμο ϋΝΑ πολυμεράση Ι Για να αντικαταστήσετε τα νουκλεοτίδια σε έναν κλώνο DNA με επισημασμένα νουκλεοτίδια. Λειτουργεί με την εισαγωγή ενός μονοκλωνικού διαλείμματος (Nicks) στο DNA χρησιμοποιώντας DNase I . Η πολυμεράση χρησιμοποιεί στη συνέχεια το Nick ως αστάρι και ενσωματώνει επισημασμένα νουκλεοτίδια στο κενό.
* ισότοπα: Τα συνήθως χρησιμοποιούμενα ισότοπα είναι ³²p-dctp ή ³²p-datp .
* Πλεονεκτήματα: Παράγει υψηλή ειδική δραστηριότητα (πυκνότητα ετικετών) και είναι κατάλληλη τόσο για ένα μονό όσο και για διπλό έλλειμμα DNA.
* Μειονεκτήματα: Απαιτεί ένα συγκεκριμένο ένζυμο και μπορεί να είναι ευαίσθητο στις συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος.
2. Τυχαία επισήμανση αστάρι:
* αντίδραση: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί σύντομους τυχαίους εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων και ϋΝΑ πολυμεράση Ι (Θραύσμα Klenow) για να συνθέσετε ένα νέο κλώνο DNA συμπληρωματικό με το κλώνο προτύπου. Η πολυμεράση ενσωματώνει επισημασμένα νουκλεοτίδια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης.
* ισότοπα: Τα συνήθως χρησιμοποιούμενα ισότοπα είναι ³²p-dctp ή ³²p-datp .
* Πλεονεκτήματα: Αποτελεσματικό και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση τόσο του μονού όσο και του διπλού κλώνου DNA.
* Μειονεκτήματα: Μπορεί να εισαγάγει κάποια επισήμανση φόντου λόγω της τυχαίας δέσμευσης του εκκινητή.
3. Τελικά ετικέτα με κινάσες:
* αντίδραση: Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί κινάση πολυνουκλεοτιδίου Για να προσθέσετε μια ομάδα φωσφορικών στο 5 'άκρο ενός θραύσματος DNA. Η ομάδα φωσφορικών είναι ετικέτα με ραδιενεργό ισότοπο.
* ισότοπα: Τυπικά ³²p-ATP ή ³3P-ATP χρησιμοποιούνται.
* Πλεονεκτήματα: Απλό και απλό, ιδιαίτερα χρήσιμο για την επισήμανση σύντομων θραυσμάτων DNA.
* Μειονεκτήματα: Μόνο επισημαίνει το 5 'τέλος του DNA.
4. Ετικέτα PCR:
* αντίδραση: Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση ραδιενεργών dntps (όπως ³²p-dctp ) Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR. Αυτό ενσωματώνει την ετικέτα στις νεοσυσταθείσες κλώνες DNA.
* ισότοπα: Τα συνήθως χρησιμοποιούμενα ισότοπα είναι ³²p-dctp ή ³²p-datp .
* Πλεονεκτήματα: Αποτελεσματικό και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση συγκεκριμένων αλληλουχιών ϋΝΑ.
* Μειονεκτήματα: Μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματική από άλλες μεθόδους και μπορεί να είναι δύσκολο να επιτευχθεί υψηλή ειδική δραστηριότητα.
5. In vitro μεταγραφή:
* αντίδραση: Χρησιμοποιεί RNA πολυμεράση Για να μεταγράψετε ένα πρότυπο DNA σε RNA. Το RNA επισημαίνεται με ραδιενεργά νουκλεοτίδια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης.
* ισότοπα: Τυπικά ³²p-utp ή ³⁵s-utp .
* Πλεονεκτήματα: Μπορεί να παράγει ανιχνευτές RNA υψηλής επισημάνσεων για μελέτες υβριδισμού.
* Μειονεκτήματα: Απαιτεί εξειδικευμένα αντιδραστήρια και συνθήκες για in vitro μεταγραφή.
Η επιλογή της μεθόδου επισήμανσης εξαρτάται από τη συγκεκριμένη εφαρμογή και τις επιθυμητές ιδιότητες του επισημασμένου DNA.
Σημείωση: Η χρήση ραδιενεργών ισότοπων μειώνεται τα τελευταία χρόνια λόγω των ανησυχιών για την ασφάλεια και της διαθεσιμότητας μη ραδιενεργών μεθόδων επισήμανσης. Ωστόσο, η ραδιενεργή επισήμανση εξακολουθεί να έχει κάποια πλεονεκτήματα σε ορισμένες εφαρμογές, ιδιαίτερα για την ευαισθησία και την ικανότητα ανίχνευσης στόχων χαμηλής αφθονίας.
